兽用诊断试剂及应用(精)/中国兽药研究与应用全书

《兽用诊断试剂及应用》一书由河南农业大学田克恭教授、洛阳普泰生物技术有限公司邓均华博士共同组织多位从事兽用诊断试剂及动物疫病防控领域的专家、学者，结合各自研究工作，参考大量国内外最新文献，历经两年撰写而成。全书分14章，从兽用诊断试剂生物活性原料，兽用ELISA类试剂，兽用免疫色谱类试剂，兽用化学发光免疫分析系统，兽用PCR类试剂，其它常见兽用诊断技术，新型兽用诊断技术，兽用诊断技术标准，产品注册、生产、质量控制及临床应用等方面进行了全面系统的阐述。本书内容翔实，既具有理论指导性，又具有实践操作性，可作为农业院校动物医学和动物药学专业、科研机构、第三方检测机构、兽药企业等从事教学、研发、检验、生产等人员的良好教学参考书和工具书。

田克恭，教授，长期从事动物疫病防控技术研究，先后供职于军事医学科学院、中国动物疫病预防控制中心、普莱柯生物工程股份有限公司、河南农业大学，率先确诊高致病性猪蓝耳病，分离鉴定43种动物病原998株，创制针对24种病原的1100余株单克隆抗体；发表研究论文339篇，其中SCI论文85篇，主编专著7部；制定国家和行业标准26项，授权发明专利126件；获兽用疫苗及诊断试剂新兽药证书41个（一类1个，二类10个），产品在全国推广应用，有力保障了养殖业持续健康发展。获国家科技进步二等奖、中国专利金奖、谈家桢生命科学奖产业化奖、中华农业科技奖一等奖、河南省科技进步一等奖等省部级一等奖以上成果10余项。

第1章绪论1 1.1我国养殖业发展现状2 1.1.1养猪业2 1.1.2养禽业3 1.1.3牛羊养殖业4 1.2我国动物疫病流行现状及防控策略5 1.2.1主要动物疫病流行现状5 1.2.2我国动物疫病防控策略10 1.3兽用诊断试剂的发展历程19 1.3.1兽用诊断试剂的发展史19 1.3.2我国兽用诊断试剂的行业现状20 1.3.3我国兽用诊断试剂的发展趋势22 主要参考文献23 第2章兽用诊断试剂生物活性原料的研制24 2.1抗原25 2.1.1抗原的定义与分类25 2.1.2天然抗原的研制27 2.1.3重组抗原的研制28 2.1.4合成多肽抗原的研制34 2.2抗体37 2.2.1抗体的定义与分类37 2.2.2多克隆抗体的研制38 2.2.3单克隆抗体的研制40 2.2.4基因工程抗体的研制43 2.3工具酶45 2.3.1工具酶的定义与分类45 2.3.2从天然材料中提取酶47 2.3.3基因工程制备酶49 2.4生物活性原料的纯化55 2.4.1生物活性原料的预处理55 2.4.2生物活性原料的初纯56 2.4.3生物活性原料的精纯59 2.4.4应用62 2.5生物活性原料的保存与质量控制63 2.5.1生物活性原料的保存63 2.5.2生物活性原料的质量控制64 主要参考文献66 第3章兽用ELISA类试剂的研制68 3.1概述69 3.2ELISA的基本原理和反应模式69 3.2.1直接ELISA70 3.2.2间接ELISA71 3.2.3竞争ELISA72 3.2.4夹心ELISA78 3.3酶标记物的制备81 3.3.1ELISA中常用酶及其底物系统81 3.3.2酶标记方法85 3.3.3酶标记物的纯化与保存89 3.3.4酶标记物的质量评价91 3.3.5新型酶的研究进展92 3.4ELISA试剂盒的组成93 3.4.1固相系统93 3.4.2酶标系统96 3.4.3样品系统97 3.4.4洗涤系统97 3.4.5对照系统98 3.4.6显色系统99 3.5ELISA类试剂研制的基本原则100 3.5.1反应载体的选择100 3.5.2缓冲体系的作用及常用缓冲体系100 3.5.3添加剂的作用及常用添加剂103 3.5.4生物活性原料的选择105 3.5.5反应条件的优化106 3.6ELISA类试剂研发的关键点107 3.6.1靶标类型及方法选择108 3.6.2质控品的建立109 3.6.3判界确定112 3.6.4性能评估115 3.7ELISA检测中的常见问题118 3.7.1样品收集118 3.7.2实验环境和仪器119 3.7.3试剂使用和保管120 3.7.4加样品及反应试剂120 3.7.5温育120 3.7.6洗板121 3.7.7显色121 3.7.8读值121 3.7.9结果判定122 3.7.10常见问题及分析122 3.8ELISA技术展望123 3.8.1高灵敏度检测123 3.8.2高通量检测125 3.8.3自动化检测125 主要参考文献125 第4章兽用化学发光免疫分析系统的研制127 4.1概述128 4.2化学发光免疫分析的原理及应用128 4.2.1化学发光原理128 4.2.2化学发光技术在免疫检测中的应用129 4.3化学发光免疫分析系统组成135 4.3.1全自动化学发光免疫分析系统135 4.3.2化学发光免疫分析系统关键技术指标142 4.4兽用化学发光免疫反应试剂144 4.4.1化学发光技术在兽用检测领域的优势145 4.4.2兽用化学发光免疫诊断试剂研制流程148 4.4.3应用实例——非洲猪瘟病毒抗体检测方法（化学发光法）151 4.5化学发光免疫分析系统研发的关键点155 4.5.1化学发光技术中的包被工艺155 4.5.2化学发光技术中的标记工艺157 4.5.3系统整合技术159 主要参考文献161 第5章兽用免疫色谱类试剂的研制162 5.1概述163 5.2免疫色谱试纸的结构165 5.2.1样品垫165 5.2.2结合垫166 5.2.3色谱膜166 5.2.4吸收垫167 5.3免疫色谱试纸的检测原理167 5.3.1直接法168 5.3.2间接法168 5.3.3竞争法169 5.4LFIA标记物169 5.4.1金纳米颗粒170 5.4.2荧光素172 5.4.3磁纳米颗粒175 5.4.4上转换纳米颗粒177 5.4.5其他标记材料180 5.5免疫色谱试剂研制的基本原则181 5.5.1样品和检测靶标的类型181 5.5.2免疫色谱试纸的检测模式182 5.5.3试纸原料筛选与确定188 5.5.4生物活性原料的筛选与条件优化192 5.5.5缓冲体系的作用及常用缓冲体系194 5.5.6添加剂的作用及常用添加剂197 5.5.7试纸反应条件的优化197 5.6免疫色谱试剂研制的关键点199 5.6.1生物活性原料及其标记技术199 5.6.2蛋白印迹工艺203 5.6.3样品垫处理206 5.6.4结合垫处理207 5.6.5反应系统的建立及优化207 5.6.6试纸贮存208 5.7免疫色谱检测的常见问题209 5.7.1纳米颗粒标记物常见问题及原因209 5.7.2假信号产生的原因210 5.7.3拦截线常见问题及原因211 5.7.4检测灵敏度问题211 5.8免疫色谱技术展望212 5.8.1高灵敏度检测212 5.8.2高通量检测216 5.8.3数字化检测217 主要参考文献218 第6章兽用PCR类试剂的研制221 6.1概述222 6.2PCR检测技术的原理与分类224 6.2.1PCR的原理及基本概念225 6.2.2几种常见PCR的原理与应用229 6.2.3荧光PCR的原理及基本概念234 6.2.4几种常见荧光PCR的原理及应用236 6.3PCR试剂研发的基本原则245 6.3.1靶基因的选择246 6.3.2引物的设计247 6.3.3探针类型和设计原则250 6.3.4引物探针的网络验证255 6.3.5荧光PCR的试验误差256 6.3.6内标类型及设置原则260 6.4PCR试剂研发的关键点262 6.4.1样品采集、处理及核酸提取262 6.4.2对照品和样品盘的制备及应用266 6.4.3绝对定量方法269 6.4.4相对定量方法273 6.4.5荧光RT-PCR反应体系279 6.5PCR试验常见的问题289 6.6PCR技术展望290 主要参考文献292 第7章其他常见兽用诊断技术297 7.1凝集试验298 7.1.1发展历史298 7.1.2反应原理和分类298 7.1.3操作步骤和关键点300 7.1.4主要技术特点304 7.2沉淀试验305 7.2.1发展历史305 7.2.2反应原理和分类306 7.2.3操作步骤和关键点309 7.2.4主要技术特点314 7.3补体结合试验315 7.3.1发展历史315 7.3.2反应原理和分类315 7.3.3操作步骤和关键点317 7.3.4主要技术特点325 7.4中和试验326 7.4.1发展历史327 7.4.2反应原理和分类328 7.4.3操作步骤和关键点329 7.4.4主要技术特点332 7.5血凝和血凝抑制试验332 7.5.1发展历史333 7.5.2反应原理和分类333 7.5.3操作步骤和关键点334 7.5.4主要技术特点339 7.6间接免疫荧光试验339 7.6.1发展历史340 7.6.2反应原理340 7.6.3操作步骤和关键点340 7.6.4主要技术特点342 7.7核酸杂交技术342 7.7.1发展历史343 7.7.2反应原理和分类344 7.7.3操作步骤和关键点347 7.7.4主要技术特点350 7.8核酸片段多态性分析350 7.8.1发展历史350 7.8.2反应原理和分类351 7.8.3操作步骤和关键点358 7.8.4主要技术特点363 主要参考文献366 第8章新型兽用诊断技术369 8.1蛋白芯片技术370 8.1.1定义和分类370 8.1.2技术特点与应用现状372 8.1.3产业化难点和关键点377 8.1.4发展趋势378 8.2基因芯片技术380 8.2.1定义和分类380 8.2.2技术特点与应用现状380 8.2.3产业化难点和关键点387 8.2.4发展趋势389 8.3微流控技术389 8.3.1定义和分类390 8.3.2技术特点与应用现状391 8.3.3产业化难点和关键点397 8.3.4发展趋势397 8.4量子点技术398 8.4.1定义和分类398 8.4.2量子点的合成和原理400 8.4.3技术特点与应用现状403 8.4.4产业化难点和关键点405 8.4.5发展趋势410 8.5核酸等温扩增技术410 8.5.1定义和分类410 8.5.2技术特点与应用现状414 8.5.3产业化难点和关键点416 8.5.4发展趋势417 8.6数字PCR技术418 8.6.1定义和分类418 8.6.2技术特点与应用现状422 8.6.3产业化难点和关键点426 8.6.4发展趋势427 8.7核酸适配体技术428 8.7.1定义和分类428 8.7.2技术特点与应用现状430 8.7.3产业化难点和关键点436 8.7.4发展趋势437 主要参考文献439 第9章兽用诊断技术国际标准442 9.1国际兽医诊断标准概况443 9.1.1世界动物卫生组织的发展历史444 9.1.2国际动物疫病诊断标准体系445 9.2动物疫病实验室诊断国际标准447 9.2.1多种动物易感染疫病447 9.2.2猪病458 9.2.3禽类动物疫病463 9.2.4反刍动物疫病472 9.2.5马病、兔病和其他疫病480 9.2.6抗微生物药物耐药性检测类国际标准481 主要参考文献484 第10章兽用诊断技术国家和行业标准485 10.1我国动物卫生标准概况486 10.1.1我国动物卫生标准的发展历史486 10.1.2动物卫生标准体系486 10.1.3动物卫生标准的作用487 10.2兽用诊断类国家标准488 10.2.1多种动物共患病488 10.2.2猪病492 10.2.3禽病502 10.2.4反刍动物疫病508 10.2.5马病516 10.2.6犬猫等宠物病519 10.2.7兔病——兔出血症521 10.3兽用诊断/检疫/检测类行业标准521 10.3.1多种动物共患病521 10.3.2猪病526 10.3.3禽病532 10.3.4反刍动物疫病543 10.3.5马病551 10.3.6兔病555 10.4兽用诊断技术国家和行业标准展望556 10.4.1补充完善动物卫生标准体系557 10.4.2继续提升兽医诊断标准质量557 10.4.3严格认真执行动物卫生标准557 10.4.4积极开展国际交流与合作558 主要参考文献558 第11章兽用诊断试剂的注册560 11.1兽医诊断制品注册相关管理法规561 11.1.1《兽药管理条例》561 11.1.2《兽药注册办法》571 11.1.3《兽医诊断制品注册分类及注册资料要求》575 11.2兽医诊断制品的注册评审程序及要点578 11.2.1兽药注册评审工作程序（参照农业农村部公告第392号）578 11.2.2申请人注意事项580 11.2.3注册评审注意要点583 第12章兽用诊断试剂的生产585 12.1兽用诊断试剂生产厂房与设施586 12.1.1厂房和设施的规划586 12.1.2环境影响评估588 12.1.3厂房和设施的技术要求591 12.1.4GMP对厂房设施的要求602 12.2生产许可证的申请606 12.2.1从事兽药生产企业应具备的条件606 12.2.2兽药生产许可证的管理607 12.2.3审批程序607 12.2.4收回与注销608 12.3兽用诊断试剂的规模化生产608 12.3.1规模化生产的一般流程610 12.3.2原辅材料质量检验621 12.3.3生产指令与标准操作规程629 12.3.4中试生产与规模化生产632 12.3.5生产过程控制/半成品质量控制635 12.3.6中间品/成品质量检验653 主要参考文献663 第13章兽用诊断试剂的质量控制664 13.1兽医检测方法的验证原则和方法665 13.1.1检测方法建立流程665 13.1.2检测方法确认流程667 13.2不同种类兽用诊断试剂的质量控制673 13.2.1酶联免疫诊断试剂的质量控制673 13.2.2免疫色谱类试剂的质量控制676 13.2.3核酸扩增类试剂的质量控制678 13.3兽用诊断试剂用质量控制物的技术要求680 13.3.1国家标准物质680 13.3.2兽药标准物质683 13.3.3体外诊断试剂用质控物686 13.3.4兽医检测用核酸标准物质的研制689 主要参考文献695 第14章兽用诊断试剂的应用696 14.1在外来动物疫病监测和预防中的应用697 14.1.1进境动物及动物产品检疫698 14.1.2高风险地区外来动物疫病监测预警698 14.2在新发突发动物疫病暴发流行中的应用699 14.2.1新发突发动物疫病确诊和疫情确认700 14.2.2暴发调查及紧急监测702 14.2.3疫情解除封锁和恢复生产确认704 14.3在本土动物疫病稳定控制中的应用705 14.3.1常发动物疫病监测（主动监测）705 14.3.2变异病原的监测预警707 14.3.3常发动物疫病诊断（被动监测）709 14.3.4免疫效果评价710 14.3.5动物检疫监督711 14.3.6兽用投入品携带病原的监管713 14.4在动物疫病净化和消灭中的应用713 14.4.1养殖场疫病净化和效果评估713 14.4.2区域净化和无疫认证718 14.5在动物疫苗研发与检验中的应用718 14.5.1动物疫苗用菌、毒、虫种鉴定719 14.5.2动物生产用细胞的纯净性检测720 14.5.3动物疫苗生产用原辅材料的质量控制720 14.5.4动物疫苗半成品或成品有效成分的定量721 14.5.5动物疫苗成品的效力检验721 14.5.6动物疫苗研发或检验用实验动物的质量控制724 14.6兽用诊断试剂的应用策略725 14.6.1试剂敏感性和特异性的选择策略726 14.6.2多种类诊断试剂的联合应用策略730 14.6.3兼顾科学性和可行性732 14.6.4试剂使用前的充分验证和使用中的质量控制733 14.7兽用诊断试剂的应用展望733 主要参考文献734