宏基因组学:方法与步骤(原书第2版)

本书共19章。详细介绍了以下内容：不同类型环境，包括海水环境、低温及碱性特别环境、植物内生环境等样本的DNA/RNA提取及宏基因组文库构建技术；从核酸、脱氧核酸、蛋白质三个角度分析环境微生物代谢活性；通过宏基因组测序获得功能基因分类及多样性的方法；从基因组学技术层面介绍复杂微生物群落的研究方法，以及挖掘活性基因（如有机物降解基因）及其表达的技术与工具；高通量地筛选活性酶基因如水解酶、纤维素酶、新型PHA代谢酶、磷酸酶、氢化酶、N-AHSL干扰酶等的方法；如何挖掘增加微生物次级代谢的信号。本书可供微生物学、环境生态学、宏基因组学等相关领域的科研技术人员、高等院校相关专业师生参考使用。

前言
贡献者
第1章 构建小插入片段和大插入片段的宏基因组文库 1
1.1 介绍 1
1.2 实验材料 2
1.2.1 宏基因组DNA 2
1.2.2 小片段文库构建 2
1.2.3 大片段文库构建 3
1.3 实验方法 4
1.3.1 小片段宏基因组文库构建 4
1.3.2 大片段宏基因组文库构建 8
1.4 注释 10
参考文献 11
第2章 从海洋过滤样本提取总DNA与RNA及用于标记基因研究的cDNA通用模板的制备 13
2.1 介绍 13
2.2 实验材料 14
2.2.1 浮游细菌样品 14
2.2.2 DNA 与RNA同时提取 14
2.2.3 提取的DNA与RNA纯化 15
2.2.4 DNA消化和PCR对照 15
2.2.5 第一链和第二链合成 16
2.3 实验方法 16
2.3.1 从海水滤膜样品中同时提取DNA与RNA 16
2.3.2 纯化DNA与RNA 18
2.3.3 第一链和第二链合成 20
2.4 注释 20
参考文献 21
第3章 海洋宏基因组大片段文库的构建与筛选 22
3.1 介绍 22
3.2 实验材料 23
3.2.1 取样 23
3.2.2 宏基因组DNA的分离 24
3.2.3 16S rDNA系统发生分析 24
3.2.4 构建宏基因组大片段文库 25
3.2.5 从宏基因组文库筛选具有群体感应抑制活性的基因 25
3.3 实验方法 25
3.3.1 取样流程 25
3.3.2 宏基因组DNA分离 27
3.3.3 16S 扩增子测序 28
3.3.4 大片段文库构建 29
3.3.5 采用PCR扩增对宏基因组文库进行基于序列的筛选 31
3.3.6 基于功能的宏基因组文库筛选32
3.4 注释 35
参考文献 36
第4章 寒冷和碱性特别环境宏基因组文库的构建与筛选 40
4.1 介绍 40
4.2 实验材料 42
4.2.1 完整的细胞提取和DNA提取 42
4.2.2 文库构建 42
4.2.3 酶活性筛选 43
4.3 实验方法 43
4.3.1 从伊卡岩柱样品中获取DNA 43
4.3.2 文库构建 45
4.3.3 低温和高pH条件下酶活性的筛选 47
4.3.4 宏基因组的偏差评估及酶潜力的检测 49
4.4 注释 49
参考文献 50
第5章 基于DNA/RNA/蛋白质的稳定同位素探针技术用于活性微生物标志物的 高通量分析 52
5.1 介绍 53
5.2 实验材料 55
5.2.1 稳定同位素探针技术所需的试剂和设备 55
5.2.2 核酸纯化 56
5.2.3 DNA/RNA超速离心 56
5.2.4 16S rRNA基因测序 57
5.2.5 宏基因组/宏转录物组测序 57
5.2.6 蛋白质纯化的试剂和设备 57
5.2.7 蛋白质胶内消化 57
5.3 实验方法 58
5.3.1 被标记的土壤和沉积物样本的酸提取 58
5.3.2 通过氯化铯梯度离心分离同位素标记的DNA 59
5.3.3 通过CsTFA分离同位素标记的RNA 61
5.3.4 宏基因组和宏转录物组分析 62
5.3.5 提取已标记样本中的蛋白质 62
5.3.6 凝胶胰蛋白酶消化 63
5.3.7 利用高分辨率质谱分析同位素标记的蛋白质 64
5.4 注释 65
参考文献 66
第6章 植物内生细菌和真菌的多样性评估 68
6.1 介绍 68
6.2 实验材料 69
6.2.1 植物样本采集 69
6.2.2 处理植物材料 69
6.2.3 从粉末化的植物样本中提取DNA 70
6.2.4 标记基因扩增 70
6.2.5 测序数据的处理 71
6.3 实验方法 71
6.3.1 植物样本采集 71
6.3.2 处理植物材料 71
6.3.3 DNA 提取 72
6.3.4 标记基因的扩增和测序 72
6.3.5 测序数据的处理 74
6.4 注释 76
参考文献 77
第7章 通过宏基因组鸟枪法测序技术研究复杂微生物群落中的植物软腐病肠杆菌科病原菌 78
7.1 介绍 78
7.1.1 软腐病肠杆菌科 78
7.1.2 分泌系统 79
7.1.3 基因水平转移 79
7.1.4 宏基因组 80
7.2 实验材料 80
7.2.1 DNA提取 80
7.2.2 DNA富集 80
7.2.3 DNA文库制备 80
7.2.4 实验室设备 80
7.2.5 软件 81
7.3 实验方法 81
7.3.1 鸟枪法宏基因组测序 81
7.3.2 实验设计和采样 82
7.3.3 组装前的数据预处理 84
7.3.4 物种多样性分析 84
7.3.5 物种和功能注释 85
7.3.6 特定的注释工具 87
7.4 注释 88
7.5 总结 88
参考文献 89
第8章 来源于宏基因组的基因在变铅青链霉菌中的克隆、表达和发酵优化 92
8.1 介绍 92
8.2 变铅青链霉菌的转化 94
8.2.1 实验材料 94
8.2.2 实验方法 97
8.3 链霉菌载体及其特征 101
8.3.1 实验材料 107
8.3.2 实验方法 109
8.4 链霉菌中的基因表达调控元件 112
8.4.1 实验材料 114
8.4.2 实验方法 115
8.5 采用基于pAMR4系统的同源重组技术将由选用的启动子控制的目的基因整合到变铅青链霉菌染色体上 118
8.5.1 实验材料 119
8.5.2 实验方法 119
8.6 重组变铅青链霉菌的发酵 120
8.6.1 实验材料 120
8.6.2 实验方法 121
8.7 注释 124
参考文献 127
第9章 基于宏基因组数据的降解网络重建 132
9.1 介绍 132
9.2 实验材料 133
9.3 实验方法 133
9.3.1 宏基因组序列中分解代谢基因的鉴定 133
9.3.2 创建降解节点列表 134
9.3.3 设定网络的节点 136
9.3.4 添加节点和网络之间的连接 136
9.3.5 设置网络中节点的坐标 139
9.3.6 绘制降解网络 140
9.4 注释 142
参考文献 142
第10章 宏基因组DNA功能表达的新工具 144
10.1 介绍 144
10.2 实验材料 146
10.2.1 细菌菌株、培养基和抗生素 146
10.2.2 载体 148
10.2.3 感受态细胞的制备：溶液和试管 150
10.2.4 用于DNA提取和纯化的溶液 152
10.2.5 商业化试剂盒 153
10.2.6 酶 153
10.2.7 DNA梯状条带 154
10.2.8 设备和材料 154
10.3 实验方法 155
10.3.1 用穿梭载体pEBP18构建宏基因组文库 155
10.3.2 用TREX表达基因簇 161
10.3.3 颖壳伯克霍尔德菌的表达 165
10.3.4 荚膜红细菌的表达 168
10.4 注释 171
参考文献 174
第11章 基于微孔板的活性和立体选择性水解酶的筛选 178
11.1 介绍 178
11.2 实验材料 179
11.2.1 琼脂板活性实验（涂平板） 179
11.2.2 微孔板培养 179
11.2.3 细胞裂解 180
11.2.4 酶活性测定 180
11.3 实验方法 181
11.3.1 琼脂板活性测试 181
11.3.2 微孔板中酶的合成 181
11.3.3 微孔板中的细胞裂解 182
11.3.4 活性或手性选择性的筛选 182
11.4 注释 183
参考文献 184
第12章 基于宏基因组文库的纤维素酶的筛选 185
12.1 介绍 185
12.2 实验材料 187
12.2.1 无机盐培养基（MSM） 187
12.2.2 刚果红板检测 188
12.2.3 细胞粗萃取物的制备 188
12.2.4 DNSA检测 188
12.2.5 纤维素酶反应产物的薄层色谱分析 188
12.2.6 通过 HPLC 分析纤维素分解产物 189
12.3 实验方法 189
12.3.1 高纤维素分解微生物群落的富集 189
12.3.2 在刚果红平板上筛选纤维素酶阳性克隆 189
12.3.3 可能阳性克隆的再转化 190
12.3.4 具有纤维素分解活性克隆的细胞粗萃取物的制备 190
12.3.5 纤维素酶活性的分析 190
12.4 注释 194
参考文献 194
第13章 利用对硝基苯基底物筛选宏基因组文库中辅助性木质纤维素酶的 液相复用高通量筛选技术 197
13.1 介绍 197
13.2 实验材料 199
13.2.1 克隆文库培养与表达 199
13.2.2 对硝基苯基底物液相检测 199
13.3 实验方法 200
13.3.1 克隆文库的叠加复用 200
13.3.2 液相pNP检测 201
13.3.3 鉴定含有目标酶的克隆 202
13.4 注释 202
参考文献 204
第14章 修饰多酚类底物的糖基转移酶的筛选 206
14.1 介绍 206
14.2 实验材料 207
14.2.1 生物转化形成反应 207
14.2.2 利用薄层色谱对转化产物进行分析 208
14.3 实验方法 208
14.3.1 宏基因组克隆文库的生物转化反应 208
14.3.2 准备宏基因组样品以供TLC分析 209
14.3.3 生物转化产物的TLC分析 209
14.3.4 酶检测 210
14.4 注释 211
参考文献 212
第15章 从复杂微生物群落中分离编码新型PHA代谢酶基因的方法 213
15.1 介绍 213
15.2 实验材料 215
15.2.1 细菌生长培养基 215
15.2.2 分子生物学试剂 216
15.3 实验方法 216
15.3.1 细菌生长和储存条件 216
15.3.2 土壤宏基因组文库的构建 217
15.3.3 利用三亲本接合法将宏基因组文库转移到苜蓿中华根瘤菌和恶臭假单胞菌中 217
15.3.4 转移来自苜蓿中华根瘤菌或恶臭假单胞菌假定的互补克隆至大肠杆菌中 217
15.3.5 遗传分子生物学 218
15.3.6 PHA积累 218
15.3.7 PHA合成克隆宏基因组文库的筛选 219
15.3.8 利用营养缺陷从宏基因组文库中分离PHB循环基因 220
15.4 注释 221
参考文献 222
第16章 基于功能宏基因组文库的磷酸酶活性编码基因的筛选和异源表达 224
16.1 介绍 224
16.2 实验材料 225
16.2.1 基于功能宏基因组文库筛选鉴定磷酸酶基因 225
16.2.2 磷酸酶基因的异源表达 226
16.3 实验方法 227
16.3.1 通过基于功能宏基因组文库的筛选鉴定磷酸酶基因 227
16.3.2 磷酸酶基因的有效异源表达 229
16.4 注释 232
考文献 233
第17章 基于活性宏基因组文库的氢化酶筛选 235
17.1 介绍 235
17.2 实验材料 236
17.2.1 实验室仪器 236
17.2.2 菌株、质粒和生长培养基 236
17.2.3 试剂盒和（性内切）酶 237
17.3 实验方法 237
17.3.1 宏基因组文库构建及其与广泛宿主载体pRS44连接 238
17.3.2 宏基因组文库中吸氢活性基因的筛选 239
17.4 注释 242
参考文献 242
第18章 基于N-AHSL信号的干扰酶筛选 244
18.1 介绍 244
18.2 实验材料 246
18.2.1 细胞培养的菌株和生长介质 246
18.2.2 N-AHSL降解实验 246
18.2.3 薄层色谱法 247
18.2.4 HPLC 247
18.3 实验方法 248
18.3.1 用于N-AHSL降解实验的RC和CCE的制备 248
18.3.2 微孔板快速筛选N-AHSL降解单克隆或混合克隆池 249
18.3.3 N-AHSL内酯酶和酰基转移酶活性筛选/N-AHSL降解验证实验 251
18.3.4 HPLC-MS鉴定N-AHSL内酯酶的活性 254
18.3.5 HPLC检测N-AHSL酰基转移酶的活性 254
18.4 注释 255
参考文献 257
第19章 挖掘微生物信号分子助力次级代谢产物的生物探索 259
19.1 介绍 259
19.2 实验材料 260
19.2.1 培养基配方 261
19.2.2 群体感应生物传感器菌株 261
19.2.3 高通量自动化筛选平台 261
19.2.4 QS信号分子的验证 262
19.2.5 HPLC-MS分析AHL和AHQ化合物的特征 262
19.2.6 在致病菌系统中验证QS活性 263
19.3 实验方法 263
19.3.1 从宏基因组文库中筛选 QS 活性克隆 263
19.3.2 QS 活性物质的提取和验证 265
19.3.3 HPLC鉴定QS活性化合物 267
19.3.4 在模式致病菌系统中实验验证AHL化合物 268
19.4 注释 269
参考文献 270