发酵工艺学实验

本书内容涵盖发酵工艺学实验基础、发酵菌种选育及保藏工艺、发酵牛化参数测定、发酵产品实验、发酵工艺的控制及优化等方面。各实验章节内容分基础实验及综合性实验两类展开。期望读者通过本书，在较好掌握基础发酵实验技能的同时，也能够对探究性实验及前沿科学进行了解及掌握。
本书可作为发酵工程、生物工程、食品科学、牛物技术等专业本（专）科生的实验指导书，也可作为硕士研究生及本领域技术人员实验的参考书。

第一章导言1
第一节发酵工艺学实验守则与安全制度1
第二节发酵工艺学实验设计的基本方法4
第三节发酵工艺学实验操作的基础知识11
第二章菌种选育及保藏工艺实验25
第一节自然选育25
实验2-1-1培养基的配制与灭菌26
实验2-1-2洁霉菌的分离纯化29
实验2-1-3乳酸细菌的分离与初步鉴定32
实验2-1-4小单孢菌的分离纯化35
实验2-1-5豆豉中高产蛋白酶菌株的筛选37
实验2-1-6产漆酶真菌菌株的筛选39
第二节诱变育种41
实验2-2-1洁霉菌的紫外线诱变41
实验2-2-2芽孢杆菌的微波诱变43
实验2-2-3曲霉菌的亚硝基胍诱变45
实验2-2-4多黏杆菌的高通量诱变筛选46
实验2-2-5营养缺陷型大肠杆菌的诱变筛选48
第三节其他常见育种技术50
实验2-3-1芽孢杆菌的原生质体融合育种50
实验2-3-2小单孢菌的原生质体融合育种53
实验2-3-3谷氨酸生产菌的原生质体诱变育种55
实验2-3-4毕赤酵母表达酶工程菌株的构建57
第四节菌种的保藏与复壮62
实验2-4-1发酵工程菌种的保藏62
实验2-4-2发酵工程菌种的复壮64
第三章发酵生化参数的测定实验66
第一节无机盐离子含量的测定67
实验3-1-1发酵液中无机磷含量的测定67
实验3-1-2发酵液中铵根离子的测定69
实验3-1-3发酵液中钙离子含量的测定70
实验3-1-4发酵液中钠、钾含量的测定71
第二节发酵液有机成分含量的测定73
实验3-2-1α-氨基氮含量的测定73
实验3-2-2蛋白质浓度的测定74
实验3-2-3总糖及还原糖含量的测定76
实验3-2-4乙醇浓度的测定78
实验3-2-5谷氨酸含量的测定79
实验3-2-6双乙酰含量的测定81
实验3-2-7苦味质含量的测定83
第三节其他常见发酵参数的测定84
实验3-3-1菌体浓度的测定84
实验3-3-2发酵菌株生长曲线的测定86
实验3-3-3体积溶氧系数的测定87
实验3-3-4效价的化学法测定89
实验3-3-5生物效价的测定90
第四章发酵产品实验95
第一节基础发酵产品的制作95
实验4-1-1酸奶的制作95
实验4-1-2甜酒酿的发酵97
实验4-1-3淡啤酒的酿制99
实验4-1-4食醋的酿制100
实验4-1-5豆腐乳的制作101
实验4-1-6酱油的酿制103
第二节典型发酵工业产品的生产106
实验4-2-1谷氨酸发酵107
实验4-2-2L-乳酸的发酵罐生产109
实验4-2-3固态发酵产纤维素酶111
实验4-2-4苏云金芽孢杆菌杀虫剂的深层发酵112
实验4-2-5基因工程菌的发酵生产115
第五章发酵工艺的控制及优化118
实验5-1发酵污染的控制与检测119
实验5-2分批补料发酵的控制与检测121
实验5-3发酵罐培养酵母动力学模型的建立123
实验5-4发酵液中溶解氧量的控制与检测125
实验5-5发酵工艺的优化设计128
主要参考文献137
附录Ⅰ缩略词表138
附录Ⅱ常用培养基的配制138
附录Ⅲ常用试（指示）剂、染色液及缓冲液的配制149

    靠前章 导言
    靠前节 发酵工艺学实验守则与安全制度
    （一）发酵工艺学实验守则
    （1）自觉遵守课堂纪律，不迟到，不早退；完成实验后将实验记录本（表）交给指导教师签字后，方可离开。
    （2）实验室保持肃静，不许喧哗、打闹，营造整洁、安静、有序的实验环境。
    （3）实验台面保持整洁，书包等物品不可放在实验台上，按规定的位置放置。药品摆放整齐、有序，公用试剂用毕应立即盖严，物归原处，勿将试剂、药品洒在实验台面和地上。取出的试剂和标准溶液，如未用尽，切勿倒回瓶内，以免带入杂质。吸头、滴管专用专放，要保证一种溶液换一支新的，防止交叉污染。使用微量移液器时，必须熟读“使用方法”，玻璃器皿轻拿轻放。
    （4）课前认真预习，切忌盲目，做好准备，提高效率。实验过程中要听从指导教师的安排，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本（表）上，文字要简练、准确。
    （5）注意节约药品、试剂、各种耗材和水电。洗涤和使用玻璃等耗材时，应小心仔细，防止损坏。如意外损坏时，应如实向指导教师报告，并填写损坏登记表，然后补领。
    （6）爱护器材、设备，面对未知仪器，须在教师的指导下使用；使用仪器，特别是贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障或损坏须立即报告指导教师，不得擅自检修。凡非正常使用造成的实验设备损坏按有关规定赔偿。
    （7）鼓励学生对实验内容和安排提出改进，对实验现象进行讨论；倡导在教学计划外做探索性、研究性实验，但需事先提出申请，经批准同意后方可进行。
    （8）实验用品一律不得擅自带出实验室。实验完毕，应将使用过的仪器洗净，并整齐地放回实验柜内。实验废弃物（如滤纸、一次性手套等），毒害性实验材料应倾倒在指定地点，统一处理，不得随意乱丢。清理好实验台，关好电闸、水龙头和煤气开关，经指导教师检查合格后才能离开实验室。
    （9）每次实验结束后由学生轮流值勤，负责打扫和整理实验室，并检查水龙头、煤气开关、门、窗是否关紧，电闸是否拉掉，以保持实验室的整洁和安全。
    （二）发酵工艺学实验安全制度
    1.安全用电
    （1）注意仪器的电压和电流要符合仪器的负载要求。
    （2）严格按照电器使用规程操作，不能随意拆卸和玩弄电器。
    （3）严防触电。绝不可用湿手触碰已开电闸和电器开关，检查电器设备是否漏电时，应使用试电笔；凡是漏电仪器一律不能使用。
    2.防止火灾
    （1）实验室起火的原因有电流短路，不安全地使用电炉、煤气灯和易燃易爆药物等。为防患于未然，实验室必须配备一定数量的消防器材，并按消防规定保管使用。很重要的是每个实验者都应有实验室安全观念，时刻保持警惕。
    （2）实验室内严吸烟。
    （3）使用煤气灯时应先将火种点燃，一手执火种靠近灯口，一手慢慢打开煤气灯，火焰大小和火力强弱应根据实验的需要来调节。煤气灯应随用随关，严防煤气泄漏；用火时应做到火着人在，人走火灭。
    （4）乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。
    （5）实验室内严贮存大量的易燃物（如乙醚、丙酮、乙醇、苯等）。应在远离火源处或将火焰熄灭后，才可大量倾倒这些液体。低沸点的有机溶剂不可在火焰上直接加热，只能利用带回流冷凝管的装置在水浴上加热或蒸馏。
    （6）离开实验室前应认真、负责地进行安全检查，关好煤气开关和水龙头，拉下电闸。
    3.严防中毒
    （1）化学试剂有相对无毒、中度毒性和剧毒之分，在处理剧毒药物时要特别谨慎、小心。靠前上常用某些标志表示不同毒性的实验化学药品。对生物危险品或放射性物质进行存放或操作的实验室也要有指定的标志。理化实验中会用到溴化乙锭、三氯甲烷（氯仿）、酚、丙烯酰胺等致癌、有毒和有害物质。
    （2）使用毒性物质或致癌物时必须根据试剂瓶上的标签说明严格操作，安全称量、转移和保管。操作戴手套，必要时戴口罩，并在通风橱中进行。沾过毒性物质或致癌物的容器应单独清洗和处理。
    （3）水银温度计、气量计等汞金属设备破损时必须立即采取措施回收汞，并在污染处撒上一层硫黄粉以防汞蒸气中毒。
    （4）所有实验用废弃物如琼脂糖凝胶、滤纸、玻璃碎片等，都要收集在废物桶里，不能倒在水槽内或到处乱扔。
    4.避免烧伤和创伤
    （1）使用玻璃、金属器材时注意防止割伤及机械创伤。
    （2）浓酸、浓碱腐蚀性很强，必须极为小心地操作，用吸量管量取这些试剂（包括有毒物）时，必须使用橡皮球，保证不能用口吸取。
    5.预防生物危害
    （1）生物材料如微生物、动物的组织、细胞培养液、血液和分泌物都可能存在细菌和病毒感染的潜在危险，如通过血液感染的血清性肝炎就属于严重的生物危害传染性疾病，主要传递途径除血液外，还包括通过其他体液传递。因此，处理各种生物材料必须谨慎、小心。在操作潜在致病性病原微生物时应该佩戴双层手套，做完实验必须立刻用肥皂、洗涤剂或消毒液充分洗净双手。
    （2）使用微生物作为实验材料时，尤其要注意安全和清洁卫生。被污染的物品必须进行高压消毒或烧成灰烬。被污染的玻璃用具应在清洗和高压灭菌之前立即浸泡在适当的消毒液中。
    （3）操作时应根据实验环境中生物因子的危害程度，采取不同级别的防护措施［生物安全防护水平（BSL）分为4级，Ⅰ级防护水平大力度优惠，Ⅳ级防护水平优选］，如张贴警示标志及配备保护性实验服、各级别生物安全柜、过滤器、消毒系统、气流循环系统，并设立单独隔离区等。
    （三）实验事故处理
    实验过程中不慎发生受伤事故，应立即采取适当的急救措施。
    （1）受玻璃割伤及其他机械损伤，首先必须检查伤口内有无玻璃或金属等物碎片，然后用硼酸水洗净，再擦碘酒或紫药水，必要时用纱布包扎。若伤口较大或过深而大量出血，应迅速在伤口上部和下部扎紧血管止血，并立即到医院诊治。
    （2）对于烫伤，一般先用乙醇溶液（90%～95%）消毒，然后涂上烫伤膏。如果伤处红痛、微肿且无水泡（一级灼伤），可用橄榄油或用棉花蘸乙醇溶液敷盖伤处；若皮肤起泡（二级灼伤），不要弄破水泡以免感染；烫伤处皮肤呈棕色或黑色（三级灼伤）时，应用干燥、无菌的消毒纱布轻轻包扎好，急送医院治疗。
    （3）强碱（如氢氧化钠、氢氧化钾）、钠、钾等触及皮肤而引起灼伤时，要先用大量自来水冲洗，再用2%或5%乙酸溶液洗涤。
    （4）强酸、溴等触及皮肤而致灼伤时，应立即用大量自来水冲洗，再以5%碳酸氢钠溶液或5%氢氧化铵溶液洗涤。
    （5）如酚触及皮肤引起灼伤，应该用大量自来水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。
    （6）当煤气中毒时，应到室外呼吸新鲜空气，若严重时应立即到医院诊治。
    （7）微生物实验中，若感染性液体（致病菌液或培养物）外溢到皮肤应立即停止工作，脱掉手套，随后用75%乙醇溶液进行皮肤消毒，再用大量自来水冲洗。而当感染性液体溅入眼睛后，也应立即停止工作，脱掉手套，迅速到缓冲区用便携式洗眼盒（图1-1）冲洗，而后用生理盐水冲洗（注意动作要轻柔，勿损伤眼睛）。
    发酵工艺学实验室应备有急救药品，如生理盐水、医用酒精、红药水、1%～2%的乙酸或硼酸溶液、1%碳酸氢钠溶液、2%硫代硫酸钠溶液、甘油、止血粉、凡士林等，还应备有镊子、剪刀、纱布、药棉、绷带等急救用具。
    实验过程中一旦发生火灾，应沉着、冷静，不要惊慌失措；应立即切断电源，熄灭附近所有火源，迅速移开着火现场周围的易燃物。特别是有机溶剂着火时，一般不能用水扑灭，否则会使火焰蔓延；小火可用湿布或石棉布盖熄，若火势较大时应根据具体情况采用相应的灭火器材。
    图1-1便携式洗眼盒
    第二节 发酵工艺学实验设计的基本方法
    发酵工艺学是利用微生物的生长代谢活动来生产商业产品的一门学科，而在研究微生物生长和代谢的试验中，由于微生物受环境条件的直接和巨大影响，以及代谢活动的多样性和调节控制的复杂性，经常需要通过大量实验来探索一个生化过程的规律，进而确定很好工艺配方或很好试验条件，使得微生物的生产潜力得到很大限度的发挥。如何安排实验，使实验次数尽量少又能达到预期理想的效果，是科学实验环节经常碰到的问题。“实验设计”则是一种专门解决该问题的方法，其通过运用数理统计的理论和方法经济、合理地安排实验方案和分析实验结果，进而减少实验次数、缩短实验周期、降低实验成本，事半功倍地迅速得到很好的结果。
    （一）实验设计（方案）的内容
    虽然本（专）科阶段的发酵工艺学实验教学仍以验证性实验为主，与科学实验的级别、种类等存在一定的差异，但基本要求是一致的。进行任何一项科学实验，在实验前必须制订一个科学、全面的实验计划，使得该项研究工作得以顺利开展，实验任务能够按时完成。科学的实验计划的内容一般应包括以下几方面。
    1.实验名称与目的
    实验课题的选择是整个研究工作的靠前步，一个合理的选题往往意味着研究工作具有一个良好的开端。总的来看，实验课题通常来自两个渠道：一是国家或企业指定的实验课题，这些实验课题不仅确定了科研选题的方向，也为研究人员很终的目标和题目的确定提供了重要参考；二是研究人员自己选定的实验课题，研究人员自选课题时，应明确研究目的是什么，要解决什么问题，以及在科研和生产中的作用效果如何等。
    2.研究依据、内容及预期成果
    确定研究对象后，可通过查阅靠前外有关文献资料，阐明项目的研究意义和应用前景，靠前外在该领域的研究概况、水平和发展趋势，理论依据、特色与创新之处。还应详细说明项目的具体研究内容和需重点解决的问题，以及取得成果后的应用推广计划，预期达到的经济技术指标及预期的技术水平等。
    3.实验方案和实验设计方法
    实验方案是全部实验工作的核心部分，主要包括研究的因素、水平的确定等，具体内容详述于后。方案确定后，再结合实验条件选择合适的实验设计方法。
    4.实验记录的项目与要求
    为了收集分析结果所需要的各个方面的资料，应事先以表格的形式列出需观测的指标，并明确实验操作中的各项具体要求。
    5.实验结果分析及效益评估
    实验结束后，对各阶段所取得的资料要进行整理与分析，所以应明确采用统计分析的方法，如t检验、方差分析、回归与相关分析等。每一种实验设计都有相应的统计分析方法，而不恰当的统计方法往往会导致错误的实验结论。需要指出的是，如实验效果显著，同时应计算经济效益。
    6.已具备的条件和实验进度安排
    已具备的条件主要包括过去的研究工作基础或预试情况、现有的主要仪器设备、研究技术人员协作条件、从其他渠道已得到的经费情况等。研究进度可根据实验内容的差异分阶段进行合理安排，定期写出总结报告。
    （二）实验设计的基本原则
    1.重复性原则
    重复就是将一个基本实验重复多次，根据一次实验的结果就下结论往往不一定准确，缺乏必要的科学严谨性及说服力。实验条件在每次实验时往往存在波动，而总体平均值波动较小，所以重复有助于减弱因波动而产生的误差，主要表现在：①估计实验误差，判断样本之间差异的显著性往往是通过误差估计值来获得的，而误差估计值则是从重复实验中得到的。②更准确地估计处理效应，减少实验误差。例如，要比较两种不同抗生素对某类病原体繁殖的抑制效果，若每种抗生素只做一次抗菌实验，抗生素a作用24h后有效抑制率达到92%，抗生素b作用相同时间后有效抑制率则为91%。这时我们难以正确判断两种抗生素抑菌效果有无显著差异，因为造成这种差异的原因可能是抗生素本身，也有可能是实验中的统计误差，故不能轻易下结论。若通过n个培养样本并进行多批次实验进行平均抑制率的比较，由于平均数方差为样本方差的1/n，当n足够大时，两种抗生素抑菌效果之间的差异就可以被认为是专一