纳米生物学交叉实验教程

《纳米生物学交叉实验教程》是为适应国家纳米生物医学领域本科人才培养需求而编写。纳米生物医学涉及生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学和纳米技术等多个学科的交叉。《纳米生物学交叉实验教程》共五章，第一章为课程简介、实验室安全及实验基本要求；第二章至第五章分别为纳米生物学交叉实验之生物化学篇、分子生物学篇、细胞生物学篇和微生物学篇，在每章首先介绍相关学科基础实验，之后介绍与之密切相关的交叉实验，并推荐了英文阅读文献。

前言
第一章课程简介、实验室安全及实验基本要求1
第一节课程简介1
第二节实验室安全规则和注意事项2
第三节常用实验室仪器的操作规范2
第四节实验数据及实验报告5
参考文献7
第二章纳米生物学交叉实验之生物化学篇8
实验一氨基酸纸层析8
实验二蛋白质的颜色反应10
实验三蛋白质的沉淀反应11
实验四考马斯亮蓝法检测蛋白质含量13
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳技术15
实验六不同种类氧化石墨烯衍生物对蛋白质的吸附能力比较18
实验七糖的颜色反应21
实验八卵磷脂的提取与鉴定22
参考文献23
第三章纳米生物学交叉实验之分子生物学篇24
实验一动物肝脏DNA的提取24
实验二氯化钙法制备感受态大肠杆菌26
实验三感受态细菌的转化27
实验四质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳29
实验五不同种类金纳米材料对质粒DNA的吸附能力比较33
实验六不同种类纳米材料的基因转染能力评价34
实验七引物设计38
实验八mRNA提取及cDNA的获取44
实验九聚合酶链反应制备目的基因47
参考文献49
第四章纳米生物学交叉实验之细胞生物学篇50
实验一动物贴壁细胞和植物细胞的显微镜观察50
实验二动物细胞的体外培养与传代53
实验三贴壁生长动物细胞的扫描电镜样品制备及观察56
实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察58
实验五鸡血细胞的体外融合59
实验六细胞显微测量62
实验七DNA的细胞化学——Feulgen反应64
实验八RNA的细胞化学——Brachet反应66
实验九植物基因组DNA的提取67
实验十不同种类氧化石墨烯的细胞毒性评价69
参考文献71
第五章纳米生物学交叉实验之微生物学篇72
实验一微生物学实验常用器皿及使用方法72
实验二微生物培养基的配制和高压蒸汽灭菌78
实验三实验室环境和人体表面微生物的检查85
实验四微生物涂片、染色及普通光学显微镜观察88
实验五革兰氏染色法的原理及应用91
实验六血球计数板的计数原理及应用93
实验七平板菌落计数法的原理及应用95
实验八不同种类纳米材料与细菌的相互作用比较97
参考文献100
附录Ⅰ常用染色液的配制101
附录Ⅱ常用培养基和缓冲液的配制104
附录Ⅲ常用指示剂的配制108

    靠前节 课程简介、实验室安全及实验基本要求

    近年来，作为一门新兴学科，纳米科学与技术的飞速发展使其在社会各领域如电子器件、通讯、能源和生物医学等领域产生了深远影响。凭借其独特的理化性质，如粒径小、比表面积大和易于进行加工修饰等，纳米材料在药物/基因载体、生物成像、生物传感器、抗菌和肿瘤免疫治疗领域显示出良好的应用前景。纳米生物医学作为其中一个重要发展方向，未来将在预防和治疗疾病、保护人类健康、提高生活质量方面发挥极其重要的作用。

    众所周知，人体由血液循环系统、免疫系统、消化系统、呼吸系统、神经系统和泌尿生殖系统组成，各系统主要由多种生物功能分子、细胞和组织构成。大量研究表明，纳米材料可通过多种途径如血液、皮肤、口腔、呼吸道等进入生物体内，并与机体中的生物功能分子（如蛋白质、DNA）和细胞等发生相互作用。因此，阐释纳米材料与生物体各生物功能分子、细胞和组织等相互作用的潜在机制，对于全面、准确地理解纳米材料的生物学效应，推进纳米材料未来应用于临床，进一步拓宽其在生物医学领域的应用范围，具有极其重要的理论价值和实际意义。

    毫无疑问，纳米材料的生物学效应及其作用机制研究涉及诸多学科领域，如材料科学、化学、生物学和医学等。为了进一步培养纳米生物医学方向的本科专门人才，使其在掌握生物基础理论和实验技能的同时，及时掌握纳米生物医学领域常用的研究手段，更加科学、准确地理解纳米材料独特的物理化学性质及其与生物体的相互作用关系，本课程在内容上设立了“生物化学基础实验”、“分子生物学基础实验”、“微生物学基础实验”和“细胞生物学基础实验”4个部分，在介绍各学科基础实验后，针对不同学科领域又分别开设了与之密切相关的纳米生物学交叉实验。本课程旨在让学生在掌握这些基础实验的理论与操作技能的同时，更加直观准确地理解相应理论课程（即生物化学、分子生物学、微生物学和细胞生物学）的专业知识。同时，结合这些理论知识和实验技能，进一步了解并掌握纳米材料生物学效应的基本研究方法，理解不同理化性质对纳米材料生物学效应的影响作用。更为重要的是，希望学生通过对纳米生物学交叉实验的学习，掌握科学研究的基本原则、设计原理和研究方法。

    第二节 实验室安全规则和注意事项

    实验室安全是顺利开展实验的基本保障，因此实验室必须有严格、正确的操作规范，实验人员必须具备较强的安全意识，严格遵守实验室安全操作的相关规定。实验室的安全规则和注意事项主要包括以下内容：

    （1）实验人员需要熟悉实验室中的安全设备如灭火器、灭火毯等的位置和使用方法。遇到紧急情况，不要惊慌，及时告诉指导教师，做好处理工作。

    （2）实验人员开展实验前，首先要掌握相关实验的基本原理，了解实验操作过程中需要注意的细节，尤其是涉及危险品的实验；其次，实验人员必须穿实验服、戴乳胶手套方可开展实验；实验过程中，若涉及易挥发试剂，需在通风橱中进行，同时还需要戴上口罩或防毒面具等，以免发生危险。

    （3）实验过程中，实验人员经常接触有刺激性或有毒的化学试剂或生物试剂，因此禁止戴手套接打电话、接触面部、头发等暴露部位；同时，禁止戴手套直接接触实验室门把手，从而减少对实验室外来人员可能造成的危害。

    （4）实验过程中，对于某些具有化学毒性或生物毒性的废液，要严格按照规定处理，并倾倒在指定容器中。例如，含重金属的废液需要收集至专门的废液桶中，不能直接倒入下水道；强酸性溶液与强碱性溶液要分别收集至废液桶中；含有细菌的废液或琼脂平板，需要先用84消毒液或通过高压灭菌处理后，方可丢弃；处死的实验动物禁止乱扔，需统一回收处理。

    （5）实验过程中若不小心打碎玻璃器皿，需要及时将碎片收集至利器回收盒中；使用过的注射器也需要经毁形处理后回收至利器盒中。

    （6）实验过程中，对于某些仪器设备不清楚如何使用的，要及时询问实验指导老师，不要随便乱调试机器，以免损坏仪器。

    （7）禁止在实验室饮食，不要高声喧哗，禁止在实验室打闹。

    （8）实验结束后，要及时清理实验操作台，并切断仪器电源。

    第三节 常用实验室仪器的操作规范

    生物实验中经常使用的仪器设备包括电子天平、移液器和高速离心机等。其具体使用方法如下。

    1.电子天平

    天平是定量分析操作中很主要、很常用的仪器，天平的称量误差直接影响着实验结果，因此掌握正确的使用方法很好重要。

    （1）首先，确认天平水平仪内气泡位于中央位置（图1.1），如果偏离位置，可调节地脚螺栓高度，使其位于中央位置，调节平衡后禁止随意挪动天平。

    （2）根据需要选择合适精度的天平（如千分之一即1mg，万分之一即0.1mg），打开电源后，将称量纸放置于称量台上，清零（Tare键），即可称取药品。结束后需及时清理称量台上撒落的药品，避免某些药品腐蚀天平。

    2.移液器

    在配制实验试剂过程中，移液器是一种推荐的工具。移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。在活塞推动下，排出部分空气，利用大气压吸入液体，再由活塞推动空气排出液体。使用移液器时，配合弹簧的伸缩性特点来操作，可以很好地控制移液的速度和力度。目前，Eppendorf公司生产的微量移液器很为常用，可分为单道微量移液器（包括1mL、200μL、20μL和10μL等多种规格）和多道微量移液器（如8道、12道微量移液器等）（图1.2）。具体使用方法如下。

    图1.1电子天平

    图1.2不同规格的微量移液器

    1）根据实验要求选择合适量程的移液器，并设定移液体积为了更加准确地吸取实验试剂，在移液体积均在两种量程移液器的吸取范围时，不要使用大量程的移液器吸取小体积的液体。例如，不要使用优选量程为100μL或200μL的移液器吸取2μL的液体，而应该选择优选量程为10μL或2.5μL的移液器。

    2）装配合适的移液器吸头 对于单道移液器，将移液器端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可。多道移液器装配吸头时，将移液器的靠前道对准靠前个吸头，倾斜插入，前后稍许摇动上紧，吸头插入后略超过O型环即可（图1.3）。禁止用移液器撞击吸头，这样会影响移液器中弹簧的准确度。同时，在日常准备实验过程中，经常需要将吸头装至吸头盒中，实验人员需要戴干净的一次性手套拿取吸头，避免污染吸头。

    图1.3装配移液器吸头的正确方法

    3）吸液和放液 在吸液和放液时，要慢吸慢放，避免液体吸入腔体。同时，在吸取到预定体积后，可在液面下停顿3s，再离开液面；使用过程中，若不慎吸入腔体时，要及时清理，避免损坏移液器。


    垂直吸液。


    吸头很好需浸入液面3mm以下。


    慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度。


    放液时吸头很好靠在容器内壁。

    4）如何更加准确地吸取一定体积的液体


    预润湿吸液：黏稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到准确移液，先吸入样液，打出，吸头内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，很后打出液体的体积更加准确。


    正向吸液与反向吸液（图1.4）：正向吸液是指正常的吸液方式，操作时吸液可将按钮按到靠前档吸液，释放按钮。放液时先按下靠前档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。反向吸液是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到靠前档即可。多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于黏稠液体和易挥发液体。对于比较昂贵的试剂或样品量较少的重要样品，优选使用正向吸液，从而降低实验成本，节省样本用量。

    5）尽量避免吸取具有强挥发性的试剂如果一定要用，必须在使用后立即拆开移液器，挥发蒸气。

    6）使用结束后，及时将移液器回调至优选量程，保证移液器的准确性对于使用时间比较长的移液器，可通过稍微旋转至超过优选量程的刻度，之后再回旋过来，从而使弹簧能够准确回复至优选量程。

    3.高速离心机

    离心机的使用需要注意以下几个方面。

    （1）根据实验要求选择合适的离心机，并设定转速或离心力。

    （2）样品离心前必须利用天平进行配平（对称两管的重量差别要小于0.2g），拧紧离心管盖子，之后将样品对称放置于离心机中。

    （3）离心管中样品体积不能过满，避免离心过程中，样品泄露，腐蚀机器。

    （4）低温高速离心机使用结束后，必须及时清理腔体中的冷凝水，防止生锈，损坏机器。

    图1.4正确的吸液方法

    第四节 实验数据及实验报告

    一、实验的准确性

    生物学实验及纳米生物学交叉实验主要涉及定性和定量分析检测。定性分析是确定存在物质的种类，或粗略计算物质所占的比例；而定量分析则需要确定物质的准确含量。因此，实验人员要根据实验要求对实验结果进行分析和总结，要善于分析和判断结果的准确性，认真查找可能出现误差的原因，并进一步研究减少误差的办法，以不断提高所得结果的准确度。

    一般在实验测量过程中都会有误差产生，通过分析原因，多数的误差是可以通过适当的处理来校正的。产生误差的原因很多，一般根据误差的性质和来源可把误差分为两类，即系统误差和偶然误差。

    1.有效数字

    做实验每天接触大量数据，什么是有效数字？是否小数点后数字越多越准确？数字1、2、3、4、5、6、7、8、9是有效数字。数字0可以是有效数字，也可能不是，如果0只用来表示小数点的位置时，它就不是有效数字。例如，0.05040kg，这个数字的前两个零都不是有效数字，它们只是用来表示小数点的位置。如改用另一个单位，即可把它们取消，如采用克为单位，就可写成50.40g。5和4之间的0，是有效数字，如去除0，数值（0.0540kg）就接近变了。很后一位0也是有效数字，它指出在该项称重中，可以测定到0.00010kg，只不过数字正好是零。如果将很后的0去除，则意味着只能称到0.0001kg。有效数字的位数说明一个测定的准确度，应当符合这个测定（包括这个测定的每一个步骤）总的准确度。综上所述，在测定的各个环节中，在可能范围内应注意选择准确度相类似的仪器，否则在某一环节使用了一次准确度很低的仪器，则整个测定结果的准确度便降低了。同样，在某一个实验环节使用了一次准确度很高的仪器，这种测量也是徒劳无功的，毫无意义。

    2.误差

    误差是指一种被测物的测定结果与其真值的不符合性，真值往往是不能确切知道的，通常以多次测定结果的平均数来近似地代表。尽管实验的分析方法相当准确，仪器也很精密，试剂纯度很高，操作者技术很熟练，然而这些都不能使某种物质的测定结果与其真值保证相符。同一个样本多次重复测定，其结果亦不能接近相同。因此实验中的误差是保证的。根据误差的来源和性质，通常可分为两大类。

    1）系统误差 系统误差是指一系列测定值存在有相同倾向的偏差，或大于真值，或小于真值，一般是恒定的。多是由于某种确定的原因引起的，在一定条件下可以重复出现，误差的大小一般可以测出。经分析找出原因，可采取一定措施，减少或纠正。


    系统误差的来源

    （1）方法误差：如用滤纸称量易潮解的药品；做生物实验，特别是酶的实验时没有考虑温度的影响等。

    （2）仪器误差：如量取液体时，按烧杯的指示线量取液体往往准确度降低，需要用量筒量取；在配制标准溶液时，量筒同样不够准确，要选用等体积的容量瓶定容到刻度线。

    （3）试剂误差：如试剂不纯或蒸馏水不合格，引入微量元素或对测定有干扰的杂质，就会造成一定的误差。

    （4）操作误差：如在使用移液管量取液体时，由于每个人的操作手法不同，可能会存在一定的操作误差。特别是在读数据时，目光是否平视，视线与液体弯月面是否相切，都可能成为实验中造成较大误差的主要原因。


    系统误差的校正

    （1）仪器校正：在