分子克隆实验指南(第4版)(平装版)(上中下)

《分子隆实验指南》一书作为基础的技术指南在世界各地的实验室已被广泛应用了30年。没有其他的手册能如此受欢迎，如此有影响力。《分子隆实验室指南（第四版）》由有名作家乔·萨姆布鲁和新的合著者--杰出的霍华德休斯医学研究所研究员迈尔·格林合作。本版保留了之前版本中备受赞誉的细节和准确性，10个原有的核心章节经过更新，反映了标准技术的发展和创新，并介绍了一些前沿的操作步骤。同时本版修订了第三版中的核心章节，以突出现有的核酸制备和隆、基因转移及表达分析的策略和方法。还增加了12个新章节，专门介绍很激动人心的研究策略，包括利用DNA甲基化技术和染色质免疫沉淀的表观遗传学分析、RNAi、新一代测序技术，以及如何处理数据生成和分析的生物信息学。基于三十年的可靠性和性，第四版的《分子隆实验指南》将成为新的金标准，再次成为一部无法绕过的分子生物学实验手册和参考指南。

目录
上册
第1章 DNA的分离及定量 1
导言 2
方案1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备 9
方案2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 12
方案3 从革兰氏阴性菌（如Ecolz中分离DNA 15
方案4 乙醇法沉淀DNA 17
方案5 异丙醇法沉淀DNA 21
方案6 用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐 22
方案7 丁醇抽提法浓缩核酸 23
方案8 聚乙二醇沉淀法制备Ml3噬菌体单链DNA 24
方案9 Ml3噬菌体铺平板 27
方案10 Ml3噬菌体液体培养 30
方案11 Ml3噬菌体双链（复制型）DNA的制备 32
方案12 利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA 35
方案13 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 37
方案14 一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质 43
方案15 从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA 46
替代方案：不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA 48
替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA 49
方案16 快速分离酵母DNA 50
方案17 微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA数量 52
方案18 利用Hoechst33258通过荧光分析仪估算DNA浓度 53
方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息栏 56
第2章 DNA分析 62
导言 63
方案1 琼脂糖凝胶电泳 73
方案2 琼脂糖凝胶中DNA的染色检测 76
方案3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 80
方案4 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 85
方案5 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 86
方案6 碱性琼脂糖凝胶电泳 87
附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影 90
方案7 成像：放射自显影和感光成像 91
方案8 用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA 96
方案9 低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提法 98
方案10 聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法 101
方案11 Southern印迹 103
方案12 Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移 110
方案13 采用放射性标记探针对固定在膜上的核酸DNA进行Southern杂交 112
附加方案：从膜上洗脱探针 117
信息栏 119
第3章 质粒载体克隆与转化 122
导言 123
方案1 制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效转化策略 126
方案2 制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：“超级感受态”细胞 131
方案3 大肠杆菌的简单转化：纳米颗粒介导的转化 135
替代方案：一步法制备感受态大肠杆菌：在同一溶液中转化和储存细菌细胞 136
方案4 电穿7L法转化大肠杆菌 138
方案5 质粒载体克隆：定向克隆 143
方案6 质粒载体克隆：平末端克隆 145
方案7 质粒DNA的去磷酸化 148
方案8 向平末端DNA添加磷酸化衔接子／接头 150
方案9 克隆PCR产物：向扩增DNA的末端添加性酶切位点 151
方案10 克隆PCR产物：平末端克隆 154
方案11 克隆PCR产物：制各T载体 157
方案12 克隆PCR产物：TA克隆 159
方案13 克隆PCR产物：TOPO TA克隆 161
方案14 使用X-Gal和IPTG筛选细菌菌落：a-互补 165
信息栏 167
第4章 Gateway重组克隆 205
导言 206
方案1 扩增Gatewav载体 210
方案2 制备可读框入门克隆和目的克隆 213
方案3 应用多位点LR克隆反应制备目的克隆 219
信息栏 222
第5章 细菌人工染色体及其他高容量载体的应用 223
导言 224
方案1 BAC DNA的小量分离和PCR检验 235
方案2 BAC DNA的大量制备和线性化 238
方案3 通过脉冲电场凝胶电泳检验BAC DNA的质量和数量 241
方案4 两步BAC工程：穿梭载体DNA的制备 242
方案5 A同源臂(A-Box)和B同源臂(B-Box)的制备 244
方案6 克隆A和B同源臂到穿梭载体 247
方案7 重组穿梭载体的制备和检验 249
方案8 通过电穿7L法转化重组穿梭载体到感受态BAC宿主细胞 251
方案9 共合体的检验和重组BAC克隆的筛选 253
方案10 一步BAC修饰：质粒制备 256
方案11 A同源臂(A-Box)的制备 259
方案12 克隆A同源臂到报道穿梭载体 260
方案13 用RecA载体转化BAC宿主 263
方案14 转移报道载体到BACiRecA细胞以及共合体的筛选 265
方案15 酿酒酵母(S.cerevisiae)的生长和DNA制备 267
方案16 酵母DNA的小量制备 269
信息栏 270
第6章 真核细胞RNA的提取、纯化和分析 275
导言 276
方案1 从哺乳动物的细胞和组织中提取总RNA 279
替代方案 从小量样本提取RNA 281
方案2 从斑马鱼胚胎和成体中提取总RNA 282
方案3 从黑腹果蝇提取总RNA 283
方案4 从秀丽隐杆线虫中提取总RNA 285
方案5 从酿酒酵母菌中采用热酸酚提取总RNA 287
方案6 RNA定量和储存 289
方案7 RNA的乙醇沉淀 295
方案8 通过无RNase的DNaseI处理去除RNA样品中的DNA污染 297
方案9 oligo(dT)磁珠法提取poly(A)+mRNA 298
方案10 按照大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳 308
方案11 根据分子质量大小分离RNA: RNA的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 312
方案12 琼脂糖凝胶中变性RNA的辖膜和固定 319
替代方案 下行毛细管转移 323
方案13 聚丙烯酰胺凝胶的电转移和膜固定 325
方案14 Northern杂交 327
方案15 纯化RNA的点杂交和狭缝杂交 330
方案16 用核酸酶Sl对RNA作图 342
方案17 核糖核酸酶保护分析：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图 349
方案18 引物延伸法分析RNA 355
信息栏 359
第7章 聚合酶链反应 363
导言 364
方案1 基础PCR 375
方案2 热启动PCR 380
方案3 降落PCR 383
方案4 高GC含量模板的PCR扩增 385
方案5 长片段高保真PCR (IA PCR) 390
方案6 反向PCR 393
方案7 巢式PCR 397
方案8 mRNA反转录产物cDNA的扩增：两步法RT-PCR 400
方案9 由mRNA的5'端进行序列的快速扩增：5'-RACE 409
方案10 由mRNA的3'端进行序列的快速扩增：3 '-RACE 416
方案11 使用PCR筛选克隆 422
信息栏 424
第8章 生物信息学 431
导言 432
方案1 使用ucsc基因组浏览器将基因组注释可视化 434
方案2 使用BLAST和ClustalW进行序列比对和同源性检索 444
方案3 使用Primer3Plus设计PCR引物 450
方案4 使用微阵列和RNA-seq进行表达序列谱分析 461
方案5 将上亿短读段定位至参考基因组上 472
方案6 识别ChIP-seq数据集中富集的区域（寻峰） 483
方案7 发现顺式调控基序 495
信息栏 503
中册
第9章 实时荧光聚合酶链反应定量检测DNA及RNA 509
导言 510
方案1 实时PCR反应用引物和探针浓度的优化 532
方案2 制作标准曲线 537
方案3 实时荧光PCR定量检测DNA 540
方案4 实时荧光PCR定量检测RNA 542
方案5 实时荧光PCR实验数据的分析和归一化 545
信息栏 550
第10章 核酸平台技术 551
导言 552
方案1 即制微阵列 560
方案2 Round AiRoundB DNA扩增 564
方案3 核小体DNA和其他小于500bp的DNA的T7线性扩增(TIAD) 567
方案4 RNA的扩增 572
方案5 RNA的Cvanine-dUTP直接标记 578
方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP间接标记 581
方案7 用Klenow酶对DNA进行Cyanine-dCTP标记 583
方案8 DNA的间接标记 585
方案9 封闭自制微阵列上的多聚赖氨酸 587
方案10 自制微阵列的杂交 589
第11章 DNA测序 595
导言 596
方案1 毛细管测序质粒亚克隆的制备 620
方案2 毛细管测序之PCR产物的制备 625
方案3 循环测序反应 627
方案4 全基因组：手工文库制备 630
方案5 全基因组：自动化的无索引文库制备 636
附加方案 自动化的文库制备 642
方案6 全基因组：自动化的带索引文库制备 644
方案7 用于Illumina测序的3kb末端配对文库的制备 651
方案8 用于Illumina测序的8kb末端配对文库的制备 659
附加方案 AMPure磁珠校准 671
方案9 RNA—Seq:RNA反转录为cDNA及其扩增 673
附加方案 RNACleanⅪ’磁珠纯化/RNA—Seq前） 679
方案10 液相外显子组捕获 680
附加方案 AMPure XP磁珠纯化 688
附加方案 琼脂糖凝胶大小筛选 689
方案11 自动化大小筛选 690
方案12 用SYBR Green-qPCR进行文库定量 693
方案13 用PicoGreen荧光法进行文库DNA定量 696
方案14 文库定量：用Qubit系统对双链或单链DNA进行荧光定量 700
方案15 为454测序制备小片段文库 702
方案16 单链DNA文库的捕获及emPCR 708
方案17 Rochei454测序：执行一个测序运行 714
方案18 结果有效性确认 721
方案19 测序数据的履量评估 723
方案20 数据分析 724
信息栏 725
第12章 哺乳动物细胞中DNA甲基化分析 729
导言 730
方案1 DNA亚硫酸氢盐测序法检测单个核苷酸的甲基化 735
方案2 甲基化特异性聚合酶链反应法检测特定基因的DNA甲基化 742
方案3 基于甲基化胞嘧啶免疫沉淀技术的DNA甲基化分析 745
方案4 高通量深度测序法绘制哺乳动物细胞DNA甲基化图谱 749
方案5 亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Roche454克隆测序 760
方案6 亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Illumina测序 765
信息栏 770
第13章 标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备 775
导言 776
方案1 随机引物法：用随机寡核苷酸延伸法标记纯化的DNA片段 792
方案2 随机引物法：在融化琼脂糖存在下用随机寡核苷酸延伸法标记DNA 798
方案3 用切口平移法标记DNA探针 800
方案4 用聚合酶链反应标记DNA探针 804
附加方案 不对称探针 808
方案5 体外转录合成单链RNA探针 809
附加方案 用PCR法将噬菌体编码的RNA聚合酶启动子加至DNA片段上 816
方案6 用随机寡核苷酸引物法从mRNA合成cDNA探针 818
方案7 用随机寡核苷酸延伸法制备放射性标记的消减cDNA探针 820
方案8 用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段标记双链DNA的3' 端 825
方案9 用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化 831
方案10 含5'突出羟基端的DNA分子磷酸化 833
方案11 去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化 836
方案12 用T4多核苷酸激酶进行寡核苷酸5'端的磷酸化 839
方案13 用末端脱氧核苷酸转移酶标记寡核苷酸3'端 841
替代方案 用TdT合成非放射性标记的探针 843
附加方案 加尾反应 843
附加方案 合成非放射性标记探针的修饰 844
方案14 用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段标记合成的寡核苷酸 845
方案15 用乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸 849
方案16 用空间排阻层析法纯化标记的寡核苷酸 850
方案17 用Sep-PakCl8柱色谱法纯化标记的寡核苷酸 852
方案18 寡核苷酸探针在水溶液中杂交： 在含季铵盐缓冲液中洗涤 854
信息栏 857
第14章 体外诱变方法 871
寻言 872
方案1 用易错DNA聚合酶进行随机诱变 879
方案2 重叠延伸PCR产生插入或缺失诱变 890
方案3 以双链DNA为模板的体外诱变：用DpnI选择突变体 897
方案4 突变型B一内酰胺酶选择法定点诱变 904
方案5 通过单一性位点消除进行寡核苷酸指导的诱变/USE诱变） 910
方案6 利用密码子盒插入进行饱和诱变 915
方案7 随机扫描诱变 922
方案8 多位点定向诱变 926
方案9 基于PCR的大引物诱变 930
信息栏 933
第15章 向培养的哺乳动物细胞中导入基因 937
导言 938
方案1 阳离子脂质试剂介导的DNA转染 942
替代方案 采用DOTMA和DOGS进行转染 948
附加方案 单层细胞组织化学染色检测B一半乳糖苷酶 950
方案2 磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 952
替代方案 磷酸钙介导的质粒DNA高效转染真核细胞 956
方案3 磷酸钙介导的高分子质量基因组DNA转染细胞 959
替代方案 磷酸钙介导的贴壁细胞的转染 962
替代方案 磷酸钙介导的悬浮生长细胞的转染 963
方案4 DEAE-葡聚糖介导的转染：高效率的转染方法 964
替代方案 DEAE-葡聚糖介导的转染：提高细胞活力的方案 966
方案5 电穿孑L转染DNA 968
方案6 通过alamarBlue法分析细胞活力 972
方案7 通过乳酸脱氢酶法分析细胞活力 974
方案8 通过MTT法分析细胞活力 977
信息栏 980
第16章 向哺乳动物细胞中导入基因：病毒载体 998
导言 999
方案1 直接克隆法构建重组腺病毒基因组 1 019
方案2 将克隆的重组腺病毒基因组释放用于挽救和扩增 1023
方案3 氯化铯梯度沉降法纯化重组腺病毒 1028
方案4 性内切核酸酶消化法鉴定纯化后的重组腺病毒基因组 1031
方案5 TCID50终点稀释结合qPCR测定重组腺病毒感染滴度 1034
附加方案 准备qPCR的DNA标准品 1042
方案6 浓缩传代和Real-Time qPCR法检测有复制能力腺病毒(RCA) 1043
方案7 瞬时转染法制备rAAV 1051
方案8 氯化铯梯度沉降法纯化rAAV 1054
方案9 碘克沙醇梯度离心法纯化rAAV 1059
方案10 肝素亲和层析法纯化rAAV2 1062
方案11 阴离子交换柱层析法从碘克沙醇梯度离心后的rAAV样本中富集接近包装病毒 1065
方案12 实时定量PCR法测定rAAV基因组拷贝数 1068
方案13 TCID50终点稀释结合qPCR法灵敏测定rAAV惑染滴度 1071
方案14 负染色法和高分辨电子显微镜分析rAAV样本形态 1074
方案15 银染SDS-PAGE分析rAAV纯度 1076
方案16 高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备 1079
方案17 慢病毒载体的滴定 1085
方案18 监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒 1089
信息栏 1091
下册
第17章 利用报道基因系统分析基因表达调控 1102
导言 1103
方案1 哺乳动物细胞提取物中B一半乳糖苷酶的测定 1112
附加方案 化学发光实验检测B一半乳糖苷酶活性 1115
方案2 单萤光素酶报道基因实验 1118
方案3 双萤光素酶报道基因实验 1123
方案4 酶联免疫吸附试验定量检测绿色荧光蛋白 1128
方案5 用四环素调控基因表达建立细胞系 1131
附加方案 有限稀释法筛选悬浮细胞的稳定克隆 1138
信息栏 1140
第18章 RNA干扰与小RNA分析 1170
导言 1171
方案1 双链siRNA制备 1185
方案2 通过转染双链siRNA在哺乳动物细胞中进行RNA干扰 1187
方案3 通过转染双链siRNA在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1190
方案4 体外转录法制备dsRNA 1192
方案5 采用dsRNA浸泡果蝇S2细胞进行RNA干扰 1196
方案6 采用dsRNA转染在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1198
方案7 小RNA的Northern杂交分析 1199
方案8 反转录定量PCR分析小RNA 1203
方案9 构建小RNA高通量测序文库 1206
方案10 抑制miRNA功能的反义寡核苷酸制备 1215
方案11 在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1216
方案12 在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1218
信息栏 1219
第19章 克隆基因的表达以及目的蛋白的纯化和分析 1225
导言 1226
方案1 在大肠杆菌中利用可用IPTG诱导的启动子表达克隆化基因 1249
附加方案 目标蛋白可溶性表达的小量试验 1255
替代方案 在大肠杆菌中利用阿拉伯糖BAD启动子表达克隆基因 1260
替代方案 信号肽融合虽白的亚细胞定位 1261
方案2 用杆状病毒表达系统表达克隆基因 1265
附加方案 噬菌斑测定法确定杆状病毒原液的滴度 1271
替代方案 用于转染昆虫细胞的杆粒DNA制备 1274
方案3用 甲醇诱导启动子AOX1在毕赤酵母中表达克隆基因 1277
附加方案 酵母培养物的冻存 1287
方案4 用于纯化大肠杆菌中表达可溶性蛋白的细胞提取物的制备 1291
附加方案 酵母细胞玻璃珠裂解法 1296
替代方案 温和的热诱导的酶裂解法制备大肠杆菌细胞提取物 1298
替代方案 用溶菌酶裂解和冻融法联用制备大肠杆菌细胞提取物 1300
方案5 采用固化的金属亲和层析纯化多聚组氨酸标记的蛋白质 1302
附加方案 Niz+-NTA树脂的清洗与再生 1309
替代方案 组氨酸标签蛋白的快速液相色谱纯化 1310
方案6 采用谷胱甘肽树脂以亲和层析纯化融合蛋白 1314
方案7 包含体中表达蛋白的增溶 1321
方案8 蛋白质的SDS-PAGE 1325
替代方案 用考马斯亮蓝进行SDS-PAGE凝胶染色的各种不同方法 1335
替代方案 用银盐进行SDS-PAGE凝胶染色 1336
方案9 蛋白质的免疫印迹分析 1340
方案 10测定蛋白质浓度的方法 1347
信息栏 1353
第20章 利用交联技术分析染色质结构与功能 1358
导言 1359
方案1 甲醛交联 1369
方案2 制备用于染色质免疫沉淀的交联染色质 1371
方案3 染色质免疫沉淀(ChIP) 1373
方案4 染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应( ChIP-qPCR) 1377
方案5 染色质免疫沉淀-芯片杂交（ChIP-chip） 1378
方案6 染色质免疫沉淀-高通量测序(ChIP-seq) 1385
方案7 交联细胞3C文库的制备 1389
方案8 环形染色质免疫沉淀（ChIP-loop）文库的制备 1393
方案9 连接产物对照组文库的制备 1398
方案10 PCR检测3C、ChIP-loop和对照文库中的3C连接产物：文库滴定与相互作用频率分析 1400
方案11 3C、ChIP-loop和对照组文库的4C分析 1404
方案12 3C、ChIP-loop和对照组文库的5C分析 1408
信息栏 1412
第21章 紫外交联免疫沉淀(CLIP)技术进行体内RNA结合位点作图 1415
导言 1416
方案1 CLIP实验免疫沉淀严谨性的优化 1424
方案2 活细胞的紫外交联和裂解物制备 1429
方案3 RNA酶滴定、免疫沉淀及SDS-PAGE 1432
方案4 3'-接头的连接祁用SDS-PAGE进行大小选择 1441
替代方案 去磷酸化RL3接头5端的标记 1445
方案5 RNA标签的分离、5二接头的连接和反转录PCR扩增 1446
方案6 RNA CLIP标签测序 1456
方案7 RNA接头胶回收及保存 1458
信息栏 1460
第22章 Gateway相容酵母单杂交和双杂交系统 1464
导言 1465
方案1 构建酵母单杂交DNA-诱饵菌株 1474
替代方案 用复性引物从DNA诱饵中获得入门克隆产物 1481
方案2 生成酵母双杂交DB-诱饵菌株 1484
方案3 从活化域捕获文库中鉴定相互作用分子 1490
方案4 高效的酵母转化 1496
方案5 用于B-半乳糖苷酶活力的菌落转移比色测定 1500
方案6 酵母克隆的PCR 1502
信息栏 1504
附录1 试剂和缓冲液 1507
附录2 常用技术 1533
附录3 检测系统 1541
附录4 一般安全原则和危险材料 1565
索引 1573

    靠前章 DNA的分离及定量
    导言|DNA分离 2
    纯化DNA的商业试剂盒 3
    DNA定量 5
    方案|1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备 9
    2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 12
    3 从革兰氏阴性菌（如Ecoli）中分离DNA 15
    4 乙醇法沉淀DNA 17
    5 异丙醇法沉淀DNA 21
    6 用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐 22
    7 丁醇抽提法浓缩核酸 23
    8 聚乙二醇沉淀法制备M13噬菌体单链DNA24
    9 M13噬菌体铺平板 27
    10 M13噬菌体液体培养 30
    11 M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备 32
    12 利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA 35
    13用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 37
    14一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质 43
    15从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA 46
    替代方案不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA 48
    替代方案一管法从鼠尾中分离DNA 49
    16快速分离酵母DNA 50
    17微型凝胶电泳后使用溴化乙锭( EB)估算条带中DNA数量 52
    18利用Hoechst33258通过荧光分析仪估算DNA浓度 53
    19用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
    信息栏| 从石蜡包埋的甲醛固定组织中提取DNA 56
    聚乙二醇 57
    a-互补 58
    X-Gal 59
    尽量降低对高分子质量DNA的损伤 59
    贪光光度法 60
    导言
    双链DNA是很好惰性的化学物质。它潜在的反应基团隐藏在中央螺旋部位，并经氢键紧密连接。碱基对外侧受磷酸键和戊糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强。如此坚固的结构和保护，使得DNA在现代犯罪现场和古代墓葬等接近不同的场所中比大多数细胞内其他成分保存时间更长。这样的化学耐久性赋予基因组DNA文库的持久性和价值，使得或大或小的遗传工程和测序计划成为可能。
    尽管双链DNA在化学上是稳定的，但它在物理结构上是易碎的。高分子质量的DNA长而弯曲、侧面不稳定，因此更容易受到很柔和的流体剪切力的伤害。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基对之间的堆积作用和DNA骨架上磷酸基团间的静电排斥力而变得黏稠。因为移液、振荡或搅拌引起的液流，在黏滞的盘绕物上产生的拖拉力，可以切断双链DNA。DNA分子越长，破坏其所需的力越小。因此基因组DNA很容易变成片段形式，并且随着分子质量增加，分离的难度也相应增加。大于l50kb的DNA分子在常规分离基因组DNA过程中易于断裂。
    DNA分离
    DNA的分离是DNA纯化、成功隆的关键步骤。DNA制备得越纯，DNA作为模板或者底物的酶反应效率会趱高。在20世纪30-40年代，科技文献中开始积累了一些从细胞中提取DNA并去除能够抑制或者竞争酶催化反应的细胞成分的方法。自此，成千上万种从不同器官、组织和体液中纯化DNA的方法被发表。一般来说，这些过程通过3个步骤便可快速成功。
    1．裂解宿主细胞，通常使用这些成分：
    ·离子去污剂，如SDS
    ·离液剂（如胍盐）
    ·与离子去污剂结合的碱
    2．从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活，如：
    ·酶水解蛋白和RNA
    ·从层析液中吸收、释放DNA（例如，玻璃粉末或者阴离子树脂；多种商品化DNA纯化试剂盒是基于 该技术进行开发的）
    ·利用有机溶剂（苯酚和／或氯仿）抽提裂解液以去除DNA溶液中的蛋白质
    3．利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子
    由于质粒被广泛应用，因此分离质粒DNA十分重要。人们使用碱与SDS裂解法从大肠杆菌中分离制备质粒DNA已有30多年的历史(Bimboim and Dolv 1979)。菌液在高pH条件下加入强离子去污剂能够破坏细胞壁，使蛋白质与染色体DNA变性，并将质粒DNA释放到上清液中。
    溶菌过程中，菌体蛋白、破碎的细胞壁和变性的染色体DNA交织成一个大的复合物，被十二烷墓硫酸盐包裹。这些复合物能够通过将钠离子替换成钾离子而被有效沉淀下来(Ish-Horowicz and Burke 1981)。离心去除变性剂后，就可以从上清液中回收复性的质粒。
    在SDS的存在下，碱裂解法是一种很好灵活、有效的方法，它对Ecolz的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从ImL到500mL以上。但是，实验中的关键是要动作快，因为长时间暴露在变性的条件下会对闭环DNA造成不可逆变性(Vinograd andLebowitz 1966)。这种变性的折叠卷曲DNA不能被酶切割，它的琼脂糖电泳速率是线性、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的两倍，并且不易被嵌入染料染色。碱裂法在制备质粒过程中常会产生不同数量折叠形式的DNA。
    这种方法适用于大小在l5kb以下的质粒。大于l5kb的质粒容易在细胞裂解和随后的处理中断裂。利用等渗蔗糖溶液裂解细菌，并用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除细胞壁，可解决受损。产生的原生质球可通过加入去污剂(如SDS)被裂解。了解更详细的方法，请详见Godson和Vapnek (1973)。
    纯化DNA的商业试剂盒
    商业公司将过去DNA提取与纯化的技术应用到试剂盒中，然后出售。它是预包装的试剂，具有很好清楚并且简洁的说明，对操作人员的要求简单，使操作人员很容易快速上手，并且结果可多次重复。这些试剂盒可用于纯化不同来源的DNA及用于不同实验目的。但现在的文献中缺少对这些试剂盒进行直接的比较。事实上，制造商现在掌握着这些资源。
    如何看待这些试剂盒是具有节省时间的优势还是具有破坏性影响，在很大程度上取决于你所处的年代和培训背景。经历过分子隆早期研宄的科学家，可能会认为试剂盒就像快餐食物一样：简单、不用思考、无创造力，是科学的仿制品。可是试剂盒使用起来如此简便，为什么要纠结它们的作用原理呢？或许无知是福吧(Grav1742)。
    试剂盒给我们带来了很多的好处：它们提供了一种高度可靠的、能够与自动化任务相融合的技术。因为仅需要很少的专业知识，所以降低了新研究者进入分子隆领域的门槛，并且加速了科学发展的进程。例如，我们可以用试剂盒从档案组织中分离其DNA从而研究遗传疾病，还可以研究恶性组织中基因表达的异常（详见“从石蜡包埋的甲醛固定组织中提取DNA”）。此外，若没有试剂盒制备的快速性和重复性，大量的样本要想满足自动DNA测序仪的需求，我们还需要几十年才能实现人类基因组测序计划。
    试剂盒就存在于我们的身边，在很多实验室中甚至是不可缺少的，不管你喜不喜欢它，它都会在日新月异的科学领域发挥越来越重要的作用。
    许多试剂盒开始利用DNA选择性吸附稳定固定相（通常是二氧化硅或者硅酸盐）的特性进行DNA纯化。很初的文章(Vogelstein and Gillespie 1979；Marko et al.1982)描述了硅酸盐粉末（碱石灰玻璃和硼硅酸盐玻璃）如何快速双定量结合DNA。在高pH、高盐缓冲液中，DNA吸附在二氧化硅介质上，在低盐浓度下可被洗脱下来。这种结合不依赖碱基配对或者拓扑学特征，可被离液剂增强，如能够破坏核酸周围水化层的胍基盐。玻璃表面的阳性离子随后可以在DNA骨架中磷酸负电基团和硅醇负电基团(Si-OH)之间形成盐桥。结合力的强度与成桥离子类型有关(Romanowski et al 1991)。一旦被吸附，在溶液中（如5%乙醇）的DNA还可以被吸附在介质上，而与其他的生物多聚物（如RNA和糖）分开。然而，当用水溶液对吸附的DNA进行水化时，DNA可被洗脱下来并（大部分）在洗脱液中被回收。得率由DNA的大小决定：片段越小，与二氧化硅结合越紧密，得率越低。洗涤缓冲液，尤其含易挥发液体的（如乙醇），应该现用现配。
    做二氧化硅试剂盒的制造商不愿意提供他们的树脂结构及特性的详细数据。许多试剂盒用二氧化硅来吸附高密度的阴离子基团来建立盐桥。这些阴离子二氧化硅有着很强的结合能力，但是批次之间的不同成为早期二氧化硅树脂被广泛应用的阻碍，现在问题已经解决了。这种结合不受溶液中的去污剂(Triton X一100)或结构破坏剂（胍基盐、碘化钠或高氯酸钠>的影响。
    阴离子二氧化硅介质可存在多种形式，如凝胶状、玻璃粉、微粒状、旋转柱、膜状和多墙平板状。二氧化硅材质经常做成平行设计，因为这样可在芯片制造中将其嵌入卡槽。依据二氧化硅材质的结构，DNA可通过重力进行吸附和洗脱，还可通过泵或离心加速该过程。商品化树脂的制造商会根据不同的情况来制订详细的DNA纯化方案。因为DNA的吸附和洗脱依赖特定树脂的结构和衍生化，制造商一般会提供说明书。
    二氧化硅材料直至今日还是高科技产物，所以价格还很昂贵，但它们能够为实验室节省很多时间和精力，进而大大提高了成本利用率。由于还有5010 -1 00io的DNA依然吸附在介质上，因此二氧化硅柱在用完一次后必须废弃。然而，我们可以将柱上残留的DNA洗去，使之再生后重新使用，这样能够降低成本(如Esser et al 2005，2006)。如果把劳动力成本考虑进去的话，这种节约是否能够提高成本效率并不明确。
    不是所有的商业试剂盒都用二氧化硅材质去结合DNA，因为DNA是一个大的多价阴离子物，在低离子强度作用的缓冲液中能够与任何阳离子结合，在高离子强度的缓冲液中被洗脱。强电荷基质能够紧密结合DNA，但是DNA的复性很好慢，尤其是在离心柱上。一些商业化试剂盒用阳离子柱效果也很好，可有效获得高纯度DNA（如Applied Biosystems公司的PrepMan诫剂盒）。
    选择哪一种试剂盒呢？目前有很多DNA制备试剂盒已经进入市场。就算实验经验匮乏的人也能够使用这些试剂盒从任何你想到的来源中提取和纯化DNA。
    生产DNA纯化试剂和试剂盒的公司有Applied Biosystems公司、Brinkmann公司、Clontech公司、Millipore公司、Agilent公司、Life Technologies公司、Promega公司及市场QIAGEN公司。目前并没有对这些公司试剂盒提取DNA的成本、效率、速度及可重复性进行比较。但这个市场竞争十分激烈，劣质产品不会存在太久。我们建议根据自己的目的来比较这些公司产品（产量、速度、花费等），然后选择一个性价比高的产品。现在涌现了很多公司推销可同时纯化多种样本DNA的工作站和自动化仪器。目前，这些仪器的主要使用者是基因组测序工厂、基因检测实验室和分子病理实验室的人。很快它们会像PCR -样普遍。
    高分子质量DNA的分离
    试剂盒纯化的基因组DNA在大小上(一般为50-lOOkb)可作为Southern杂交和PCR的模板。因此，当DNA用于特定用途如构建基因组文库（隆的DNA大小尤为重要）时，商品化的试剂盒用处币大。为使剪切力降到大力度优惠，200kb大小的DNA可用去污剂裂解细胞，强蛋白酶(如链霉蛋白酶和蛋白酶K)处理裂解液，并利用有机溶剂进行多次萃取（一般为水饱和的酚一氯仿溶液）。很后的水相经过广泛透析以去除低分子质量的污染及调整离子浓缩。如果可能，尽量避免用乙醇沉淀DNA。
    此方法的雏形可追溯到60年以前。如果操作足够谨慎和耐心，有机溶剂萃取可产生足够大分子质量的基因组DNA，以用于在某些高容量载体中构建真核基因组DNA文库。
    尽管此方法值得尊敬，但与其他实验室常规方法相比，仍是对技术与耐心的巨大挑战，并且也有一些缺点。例如，该过程需使用有毒试剂，并且涉及多次水相与有机相的费力分离；长DNA很容易断裂，很好容易被切割成小的片段。成功的关键在于通过使用宽口径的移液器，避免振荡、涡旋和乙醇沉淀，以及避免色谱树脂降低剪切力。高分子质量的DNA分离方法无法自动化，并且不适合多个样本的平行操作。
    在以下情况下需要更加谨慎以降低剪切力对DNA的影响：利用高容量载体如YAC（酵母人工染色体）或BAC（细菌人工染色体）构建基因组文库时；或DNA样品从常染色体通过脉冲电泳进行分离时。为避免DNA被打断，琼脂中固定的宪整细胞用酶处理以破坏其细胞壁并去除细胞蛋白。释放的DNA可在琼脂槽中被固定，并在原位被酶水解，这与DNA在溶液中是相同的(了解更详细的分离及分析超高分子质量DNA的方法，详见Birren and Lai 1993)。
    DNA定量
    确定DNA的数量对于分子隆中获得可重复、准确及有效的结果是十分必要的。常规使用3种方法进行DNA定量：紫外分光光度法、荧光分析法和保证定量法。
    紫外分光光度法
    紫外分光光度法是利用分光光度计来测定DNA溶液的吸收值（见信息栏“分光光度法”）。在水相中，双链DNA在260nm附近具有优选吸光度，吸光系数约为50。实际上，双链DNA的紫外光谱范围从约4ytgimL到约50ytgimL。然而，分光光度计法定量对多种干扰成分十分敏感，这些成分可以是单链DNA、RNA、蛋白质、核苷酸、含有苯环的芳香族化合物及溶液中的颗粒等。
    通过测定单波长( 260nm)下的吸光度来定量核酸浓度实际效果并不好。样品的吸光度可以在多个波长下（230nm、260nm、280nm与320nm）进行测定，因为在这些波长下的吸光度可指示样品制备的纯度。
    ·230nm。胍盐、苯氧基离子、硫氰酸酯及其他经常用于核酸制备的化合物在该波长下具有强吸收。
    ·280nm。芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸在该波长下具有强吸收。多年以来，260nm与280nm的吸光 度比值一直用于检测核酸中是否污染了蛋白质。这顼测定尽管十分普遍，但却值得怀疑。这个方 法需追溯到Warburg和Christian (1942)的研究，他们发现OD260iOD280比值是核酸中是否污染蛋 白质的很好的指示。但事实上这并不是真的！DNA在260nm的吸收很强，只有在被大量蛋白质污染 的条件下才会引起两个波长下吸光度比值的显著变化。
    ·320nm。在高波长下的吸收一般是由光散射造成的，可用于指示核酸制备过程中特定物质引起的 浊度。
    根据实验经验，OD260iOD280比值在17-20，并且在230nm和320nm处吸收度较小的DNA制备物，被认为是纯度足够高，可以作为分子隆各个过程中的模板和底物。
    测定DNA溶液的吸光度可以使用传统的分光光度计或针对生物大分子设计的仪器（如Eppendorf公司Biophotometer）。详细信息见信息栏“分光光度法”。
    紫外光谱使用的是石英杯，各种形状及大小均可，包括多数实验室测定DNA浓度常用的微量杯或超微量杯。当使用超微量石英杯时，应确保其窗口高度与特定分光光度仪的射束高度相匹配。如果窗口高度错误，光束要么接近不能穿过样品，要么需要更大体积的样品才能得到结果。
    NanoDrop Technologies铛售的分光光度仪可用于测定微量体积DNA、RNA和蛋白质的吸光度。这种分光光度仪利用光束下表面张力仅需要微量液滴(l-2ytL)，进而避免需要石英杯及其他样本容器。此外，NanoDrop分光光度仪不需要稀释即可测定高浓度的DNA溶液（比标准的石英杯分光光度仪所能测量的浓度要高50倍）。
    接触样品的表面很好容易并快速地被清洗，因此可在短时间内测定多个样品。为避免问题产生，可进行下列操作。
    ·确保DNA溶液在测定前充分混匀。因为样品体积很小(2ytL)，没有混匀会使取得的样品不具有代 表性。
    ·少量体积样品加入到分光光度仪的底座后，会很快挥发，并导致测出的DNA浓度比实际的要高。 为减少这个问题的影响，可将NanoDrop分光光度仪放在温度可控、通风的环境下，并保持样品放 置于盖了盖子的管中。操作要快。应该在样品加到分光光度仪底座后尽快读数。
    荧光分析法
    荧光分析法用特定结合DNA的染料来测定双链DNA的浓度。常用的DNA染料包括溴化乙锭、Hoechst33258、SYBR Green I和II、SYBR Gold及PicoGreen。
    溴化乙锭
    溴化乙锭含有三环菲啶平面环系统，可嵌入到双链DNA碱基之间。嵌入DNA双螺旋后，溴化乙锭的菲啶环平面位于与螺旋轴相垂直的位置，并通过范德瓦耳斯力与上下碱基结合。而其平面环系统被埋在底部，其外侧的苯基和乙烷基处于DNA双螺旋的大沟内。在高强度离子溶液的饱和状态，大约每2 5个碱基对嵌入一分子的溴化乙锭，这与DNA的碱基组成无关。溴化乙锭的嵌入一般不会对碱基对的构象及其在螺旋中的位置产生影响，除了会使碱基对沿螺旋轴移位34A (Waring 1965)。这种移位可造成饱和溴化乙锭的DNA分子长度增加27010 (Freifelder 1971)。
    溴化乙锭还可以高度可变计量学与RNA和热变性或单链DNA形成的链间碱基对结合LWaring 1965，1966; Lepecq and Paoletti 1967)。溴化乙锭平面基团的固定位置及其与碱基的密切接近可使结舍的染料散发的荧光比游离在溶液中的染料要强20-25倍。254nm的紫外线(UV)照射由DNA吸收，并转移至溴化乙锭；302nm和366nm的紫外线照射由溴化乙锭本身吸收。在590nm和可见光的红一黄区一小部分（约0 3）可被重新释放出来LLepecqand Paoletti 1967; Tuma et al 1999).
    大多数销售的UV光源可发射302nm的UV光。溴化乙锭-DNA复合物在此波长产生的荧光明显强于366nm，但略微低于较短的波长(254nm)。然而，DNA分子的光漂白和断裂作用在302nm要比在254nm处低得多(Brunk and Simpson 1977)。
    溴化乙锭主要用于检测琼脂糖中的DNA（Aaij and Borst 1972; Sharp et al 1973），但这种染料也还可以用于半定量地估算DNA溶液的浓度(见方案17)。
    ▲在酵母及沙门氏菌中，溴化乙锭本身并不容易诱发突变，但它通过微粒体酶代谢的化台物可中度诱变( Mchler and Bastos1974：McCann et al 1975; MacGregor and Johnson 1977，Singer et al 1999)。多数研究所开发了安全操作厦处理含有溴化乙锭溶液及胶的说明。研究者应该根据这些说明来处理溴化乙锭。安全处理溴化乙锭的试剂盎也可通过Schleicher＆Schuell和Qbiogene公司及其他渠道获得。
    Hoechst 33258
    Hoechst 33258是一类双一苯并眯唑荧光染料，可高特异性非插入地结合于DNA双链的小沟。结合的染料产生的荧光从0 01上升到06 (Latt and Wohlleb 1975)，因此，Hoechst33258用于双链DNA溶液的荧光检测及定量。Hoechst 33258比溴化乙锭更优先使用，因为它具有很好强的区分双链DNA与RNA及单链DNA的能力(Loontiens et al 1990)。
    与其他非嵌入染料类似（Mllller and Gautier 1975），Hoechst 33258可优先结合DNA螺旋中的富含AiT区(Weisblum and Haenssler 1974)，并随着A+T含量的增加，荧光强度以10的对数增长(Daxhelet et al 1989)。Hoechst 33258与双链DNA结合产生的荧光比与单链DNA结合要强3倍左右（Hilwig and Gropp 1975）（见方案18）。
    SYBR Green l
    SYBR Green I(Life Technologies)足一种嵌入型青蓝色染料，在488nm蓝色光照射激发后，在522nm（绿光）具有发射高峰。尽管SYBR Green I可加入到凝胶上样缓冲液中，但并不推荐这样使用，因为该染料对DNA在凝胶中的迁移影响很大。为得到优选的效果，凝胶应该进行预染处理。由于产生的荧光很强，SYBR GreenI是一种可用于检测少量DNA