病原生物学实验

本教材主要包括3个方面的内容：1.经典验证性实验通过对人体寄生虫学实验标本的观察，以巩固理论知识和培养学生的实践动手能力；2.综合性实验融合了人体寄生虫学及其相关学科知识，结合科研而设计的一些实践性实验，以培养学生综合运用所学知识、分析和解决实际问题的能力；3.设计创新性实验根据基础医学科研和临床医学实践的实际需要，由教师提出问题，并在教师引导下由学生自行设计和完成的一些实验，以培养学生的独立解决问题以及创新能力。

第一篇经典验证性实验
第一章医学原虫
第一节叶足虫
第二节鞭毛虫
第三节孢子虫
第四节纤毛虫
第二章医学蠕虫
第一节吸虫
第二节绦虫
第三节线虫
第三章医学节肢动物
第一节昆虫纲
第二节蛛形纲
第二篇综合性实验
第四章医学原虫
第一节人体感染齿龈内阿米巴和口腔毛滴虫的检查
第二节荧光染色法检测阴道毛滴虫
第三节鼠疟原虫的人工感染和保种
第四节弓形虫的病原学和免疫学检查
第五章医学蠕虫
第一节实验动物华支睾吸虫的人工感染
第二节肺吸虫病动物模型的建立
第三节日本血吸虫感染的免疫学检查
第四节蛙肉内裂头蚴的检查与接种
第五节蛔虫生活史过程的验证
第六节旋毛虫病的人工感染和免疫学检查
第六章医学节肢动物
第一节蚊成虫及幼虫标本的采集与保存
第二节人体感染蠕形螨的检查
第三篇设计创新性实验
第七章医学原虫
第一节溶组织内阿米巴病的PCR诊断
第二节阴道毛滴虫的体外药敏实验
第八章医学蠕虫
第一节日本血吸虫病动物模型的建立、解剖及病理变化观察
第二节学龄前儿童蛲虫病的现场调查
第三节市售蔬菜土源性线虫卵与幼虫污染调查
第九章医学节肢动物
第一节家蝇幼虫抗菌物的提取及抑菌实验
第二节高校学生宿舍内尘螨污染状况的现场调查
第四篇寄生虫学常用实验技术与方法
第十章常用试剂的配制
第一节常用标本固定液的配制
第二节常用标本染色剂的配制
第十一章寄生虫病实验诊断技术
第一节病原学实验诊断技术
第二节免疫学诊断技术
第三节分子生物学诊断技术
第五篇寄生虫学病例讨论
第十二章医学原虫
第十三章医学蠕虫
第十四章医学节肢动物
附录一寄生虫标本的类别与实验观察方法
附录二寄生虫学实验报告绘图要求
附录三医学蠕虫和医学原虫实验标本总复习

    **篇  经典验证性实验

    **章  医学原虫

    **节  叶  足  虫

    一、溶组织内阿米巴

    溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）寄生于人体肠道和其他器官，侵入宿主组织，引起肠内、肠外阿米巴病。溶组织内阿米巴生活史可分为包囊和滋养体两个时期，感染阶段是 4核成熟包囊（cyst），致病阶段是滋养体（trophozoite）。溶组织内阿米巴 4核成熟包囊经口摄入后，在肠道内酶和自身运动的作用下，囊内虫体脱囊而出。 4核虫体经分裂后发育为 8个滋养体，随即在结肠上端摄食细菌并进行二分裂增殖。在肠内下移过程中，受到环境变化的影响，虫体变圆，然后分泌成囊物质形成包囊，随粪便排出。包囊在外界潮湿环境中可存活并保持感染性数日至1个月，但在干燥环境中易死亡。滋养体可侵入肠黏膜，吞噬红细胞，破坏肠壁引起肠壁溃疡；也可随血流进入其他组织或器官，引起肠外阿米巴病（extraintestinal amoebiasis）。随坏死组织脱落进入肠腔的滋养体可随粪便排出体外，在外界环境中存活时间很短。

    溶组织内阿米巴病原学检查注意事项：取脓血粪便、痰液、脓液或用乙状结肠镜检、直肠窥镜取肠黏膜溃疡边缘活组织或刮取物作直接涂片查组织型滋养体；取稀便作涂片查肠腔型滋养体；取成形粪便离心沉淀查包囊。作滋养体检查时应注意，快送快检，一般在 30min内完成；冬天应注意保持 25～30℃以上的温度，必要时可用保温台保温，或先将载玻片和生理盐水略加温，使滋养体保持活动状态；避免尿液污染粪便，便于观察到活的虫体；盛装标本的容器要干净、干燥且不含任何化学药品。

    溶组织内阿米巴实验室诊断要点为：每份标本至少检查 3次，以免漏诊；通过直接粪检（生理盐水涂片法和碘液染色法）不能确诊的标本，必须用铁苏木素染色等方法加以鉴别；血清学检查作为辅助性诊断方法，在肠阿米巴患者中，抗体未必都是阳性，而在肠外阿米巴患者中，抗体阳性率高。

    【实验目的】

    （1）掌握溶组织内阿米巴滋养体及包囊的形态结构特征。

    （2）掌握溶组织内阿米巴滋养体的活动方式。

    （3）掌握碘液染色方法。

    （4）熟悉溶组织内阿米巴滋养体的培养方法。

    （5）了解溶组织内阿米巴病病理标本形态特点。

    【实验内容】

    1.实验观察内容

    （1）观察溶组织内阿米巴滋养体和包囊的形态。

    （2）观察溶组织内阿米巴活滋养体的运动方式。

    （3）观察溶组织内阿米巴病病理标本。

    2.实验操作内容

    （1）溶组织内阿米巴滋养体生理盐水涂片法。

    （2）溶组织内阿米巴包囊碘液涂片法。

    （3）溶组织内阿米巴的培养。

    【实验观察】

    1.滋养体（trophozoite）

    （1）铁苏木素染色标本：阿米巴痢疾患者黏液血便涂片，经铁苏木素染色（iron hematoxylin stain）的玻片标本。先在低倍镜下找到清晰均匀的界面，换高倍镜查找，发现疑似虫体（蓝黑色、边界分明的圆形或椭圆形小体，外围有一空白圈）后仔细观察，若有较清晰的泡状核，内质中有若干个被吞噬的红细胞（黑色点状），则证明已找到滋养体。将其移向视野中央，并在载玻片上滴加镜油1滴，转换油镜观察。此时只可用细螺旋调节器纠正焦距，切不可用粗螺旋调节器，否则容易损坏镜头和标本。

    滋养体形状多变，多为圆形或椭圆形，虫体大小不一，直径为12～60μm，多为 20～30μm，平均为 25μm。

    经铁苏木素染色后，滋养体呈蓝灰色，内、外质分界明显。外质（ectoplasm）无色透明，不很清晰，伪足不明显或不易看到，如有伪足（舌状或指状），则在伪足处外质*明显；内质（endoplasm）为蓝黑色的颗粒状，颗粒细小、均匀，食物泡中含有圆形、大小不等、被染成墨黑色的红细胞（erythrocyte）。衰老的滋养体内质中可出现空泡（vacuole）。

    核（nucleus）1个，圆形，呈泡状，核膜（nuclear membrane）内缘有大小一致、排列整齐的核周染粒（chromatin granules）；核仁（karyosome）1个，小而圆，亦呈黑色，多位于核中央，也可略偏位。核仁与核周染粒间有时可见放射状排列、着色较浅的网状核丝（图1-1）。滋养体细胞核的结构特征及胞质中是否含有摄入的红细胞，是鉴别虫种的重要特征。

    （2）活体标本：此标本取自体外培养悬液，置低倍镜和高倍镜下观察，不可用油镜观察。因虫体无色透明，故视野光线不宜太强。观察要及时，冬天注意保温（可把标本放在保温台上观察）。注意观察滋养体的结构及运动形式。

    活动的阿米巴滋养体一般源于有菌或无菌培养。若为有菌培养的虫体，虫体透明，呈圆形或卵圆形，大小为10～30μm，转高倍镜后见虫体运动缓慢，运动时外质伸出叶状或舌状伪足（pseudopodia），内质流入伪足，虫体形态随之而变，即为阿米巴运动。内质颗粒状，食物泡内含细菌或淀粉颗粒（勿认为是红细胞或细胞核），细胞核不易见到。若为无菌培养的虫体，内质颗粒状，外质不断伸出形成伪足，运动较快，隐约可见1个以上的核，但核内结构不清。

    2.包囊（cyst）

    （1）铁苏木素染色标本：采自慢性感染者或带虫者的成形粪便涂片，经铁苏木素染色的玻片标本。先在低倍镜下找到清晰均匀的界面，换高倍镜查找，发现疑似虫体（蓝黑色、边界分明的圆形小体，外围有一空白圈）后，将其移向视野中央，并在载玻片上滴加镜油1滴，转换油镜观察。

    1）形状与颜色：圆球形，直径为10～20μm，平均12μm；包囊经铁苏木素染色后呈蓝灰色，囊壁厚为125～150nm，薄而光滑，折光性强，不着色。

    图1-1  溶组织内阿米巴滋养体模式图

    2）细胞核：囊内可见1～4个泡状核（图1-2）。单核包囊的核较大，结构较清晰，与滋养体的核相似。成熟包囊有4个核，核较小，有的仅只能见到核的轮廓。有的包囊核膜内侧的染色质粒分布不匀，集中到一侧，如同新月形。

    图1-2  溶组织内阿米巴包囊模式图

    A.单核包囊；B.双核包囊；C. 4核成熟包囊

    3）囊内容物：未成熟包囊胞质内可见深黑色、两端钝圆的棒状拟染色体（chromatoid body）（一般为1～3个），以及空泡状的糖原泡（glycogen vacuole）。4核成熟包囊一般见不到拟染色体和糖原泡。

    观察时应注意 ：包囊是一个立体结构，细胞核、拟染色体、糖原泡可能不在同一焦距层面出现，应正确使用显微镜细螺旋调节器，在不同层面观察包囊的内部结构和计数全部核数目。

    （2）碘液染色标本：吸取1～2滴保存的包囊悬液，滴于载玻片上，经碘液染色后进行观察。包囊呈圆球状，直径为10～20μm，因碘液染色呈棕黄色，内部结构必须（且只能）用高倍镜观察，切勿用油镜观察。囊壁薄而透明（发亮），细胞核1～4个，不着色，呈小亮圈状，核内有一亮点状核仁。糖原泡被染成棕红色，但边缘模糊。拟染色体不着色，呈透明的棒状或点状。

    观察包囊时必须与人酵母菌和脂肪滴相鉴别：人酵母菌形状大小不同，内有较大的空泡；脂肪滴反光性强，不着色，内无任何结构。

    3.病理标本

    （1）阿米巴痢疾肠病理标本：10%甲醛浸制，瓶装标本，肉眼观察。溶组织内阿米巴滋养体侵入肠黏膜下层繁殖，破坏肠黏膜，形成口小底大的烧瓶状溃疡。溃疡底部向四周扩展，使相邻溃疡底部互通形成隧道。肠黏膜上可见多个开口小的溃疡面，偶见黏膜破絮状大片坏死。

    （2）阿米巴肝脓肿病理标本：10%甲醛浸制，瓶装标本，肉眼观察。溶组织内阿米巴滋养体随血流经门静脉进入肝，引起肝组织坏死、液化，形成脓肿。脓肿常为单个。大的脓肿可见明显的脓肿壁，为纤维组织所形成，脓腔内有未被溶解的结缔组织，形成肝组织支持架，呈带状贯通脓腔中间。

    【实验操作】

    1.滋养体生理盐水直接涂片法

    （1）实验材料：载玻片、盖玻片、竹签和生理盐水。

    （2）操作方法：在洁净的载玻片中央，滴生理盐水1滴，用竹签取火柴头大小的黏液血便，在生理盐水中混匀，摊开呈薄膜状，加盖玻片后镜检。一般在低倍镜下检查，如发现可疑物再转高倍镜观察。

    检查滋养体时应与宿主组织细胞相鉴别，区别要点如下：溶组织内阿米巴滋养体大于宿主细胞；虫体胞核与胞质大小比例低于宿主细胞；滋养体为泡状核，核仁居中，核周染粒清晰；滋养体胞质中可含有红细胞和组织碎片。此外还应注意区分滋养体与中性粒细胞。

    2.包囊碘液染色涂片法

    （1）实验材料：载玻片、盖玻片、卢戈碘液、竹签和吸水纸。

    （2）卢戈碘液配方：碘化钾 4g、碘 2g、蒸馏水100ml。

    （3）操作方法：取1滴卢戈碘液加于载玻片中央，用竹签挑取米粒大小的粪便置于碘液中，调匀涂片，厚度以透过涂片约可看清书上的字迹为宜。盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余溢出的液体，置于低倍镜下观察，见圆球形小体，再转高倍镜（不可用油镜）观察包囊的结构特点。

    （4）注意事项：碘液不宜太多太浓，否则着色过深，粪便凝成团块，包囊折光降低且结构不易看清，不利于观察。

    3.溶组织内阿米巴培养当受检者临床表现和体征疑为阿米巴病，而病原学检查为阴性时，可采用人工培养进一步确诊，以便及时针对病因进行治疗。

    常用培养基：营养琼脂双相培养基、 Locke液鸡蛋血清培养基、鸡蛋斜面培养基、血清斜面培养基。这里以血清斜面培养基为例，简单介绍溶组织内阿米巴的培养。

    （1）实验材料：无菌血清、消毒米粉、培养管、接种棒、吸管、温箱、烤箱、载玻片、盖玻片和盖液。

    （2）培养液配制：分液相和固相两部分。液相部分（盖液）：蛋白胨1g，氯化钠 0.5g，蒸馏水100ml，55kPa 20min灭菌待用。固相部分（血清斜面）：将4 ml无菌血清分装到培养管中，放入烤箱内（使试管倾斜），

    加热到 90℃，1h后即制成斜面。取出固相部分，接种前每管加液相部分4～5ml，再加少许消毒米粉和青霉素、链霉素各1000U/ml。

    （3）操作方法：用接种棒取被检者黏液血便少许，接种到培养管里与液相部分混匀，置 37℃温箱中培养，于 24h、48h、72h取沉淀镜检有无阿米巴生长。

    （4）结果观察：若粪便中含有溶组织内阿米巴滋养体，镜检时则可见作阿米巴运动的活滋养体。

    （5）注意事项：制作斜面使用的血清一定要严格无菌；加热温度不能超过 90℃，否则血清会被烤焦而不能使用；若培养后的镜检物中无滋养体，需再次检查，以免漏诊。

    【作业与思考题】

    1.课堂作业  用普通铅笔绘溶组织内阿米巴滋养体和包囊的黑白点线图（铁苏木素染色标本），显示其在油镜下所见特征，并注明结构名称、放大倍数和染色方法。

    2.课后思考题  溶组织内阿米巴致病机制是什么？如何进行诊断？

    二、结肠内阿米巴及其他非致病性阿米巴

    寄生于人体消化道的阿米巴除溶组织内阿米巴外，其余均为腔道共栖原虫，一般不侵入人体组织，但在重度感染或宿主防御减弱时，也可引起不同程度的肠黏膜浅表炎症，合并细菌感染时可引起腹泻或肠功能紊乱。

    结肠内阿米巴（Entamoeba coli）寄生于结肠，不侵入组织，亦无临床症状，常与溶组织内阿米巴共同存在，其形态与溶组织内阿米巴**相似。

    迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）形态、生活史几乎与溶组织内阿米巴接近相同，光学显微镜下不能鉴别，但其滋养体无侵袭性，不吞噬红细胞；且其表面抗原决定簇、同工酶谱和基因与溶组织内阿米巴接近不同，可采用分子生物学技术进行鉴别。

    【实验目的】

    （1）掌握结肠内阿米巴滋养体及包囊的形态结构特征。