乳酸细菌现代研究实验技术

本书全面的介绍了乳酸细菌的分类和近200个研究实验方法，既有坚实的理论基础，又有丰富的实验经验，内容新颖、全面、系统，能反映本领域国内外的近期新研究成果和高新技术，在国内外市场暂无同类书籍的情况下，是一本的优秀参考书。

《乳酸细菌现代研究实验技术》是作者郭兴华和凌代文等编著的有关乳酸细菌的多部专著之一。全书共介绍了近200个研究实验方法，既有坚实的理论基础，又有丰富的实验经验，内容新颖、全面、系统，能反映本领域国内外的近期新研究成果和高新技术，为研究乳酸细菌的分类和鉴定提供了现代的和传统的技术；为探讨乳酸细菌的生理功能和安全问题提供了方法；为乳酸细菌在各个领域的应用提供了实验技能；为乳酸细菌改造提供了基因重组的手段。所以本书是乳酸细菌领域关于研究、开发、生产、使用的一本重要工具书。
《乳酸细菌现代研究实验技术》对从事微生物学、微生态学、免疫学、营养学、临床医学、老年学、动物学、兽医学和遗传学的研究人员、教学人员、博士生、硕士生，以及从事生物制药、临床化验、生化分析、发酵工业、保健食品、食品安全、乳品发酵、泡菜发酵、青贮饲料等的工作人员和消费者都有重要的参考价值。

郭兴华，中国科学院微生物研究所研究员，已退休。一直致力于乳酸细菌的研究和产业化，著有多部相关著作。

第一篇乳酸细菌的分类鉴定
第一章 乳酸细菌的分类及有关属的特性
第一节 乳酸细菌的定义及其范围
一、乳酸细菌的定义
二、乳酸细菌范围的界定
三、乳酸细菌有关的属
第二节 乳酸细菌的分类位置
一、伯杰氏细菌分类系统
二、乳酸细菌分类近史
三、乳酸细菌在细菌系统中的位置
第三节 乳酸细菌有关属类群的划分
一、乳杆菌属及其有关属
二、肠球菌属及其有关属
三、双歧杆菌属及其有关属
四、芽孢杆菌和梭菌的有关属
五、近年报道的且尚未编入《伯杰氏系统细菌学手册》第二版的新属
第四节 乳杆菌属和有关属及其特性
一、乳杆菌属(Lactobacillus Beijerinck 1901)
二、类乳杆菌属(Paralactobacillus Leisner et a1．2000)
三、片球菌属(Pediococcus Claussen 1903)
四、气球菌属(Aerococcus Williams et a1．1953)
五、营养缺陷菌属(Abiotrophia Bouvet et a1．1989，Kawamura et a1．1995)
六、肉食杆菌属(Carnobacterium Collins et a1．1987)
七、碱杆菌属(Alkalibacterium Ntougius and Russell 2001)
八、德瑟兹氏菌属(Desemzia Stackebrandt et a1．1999)
九、棍状菌属(Isobaculum Collins et a1．2002)
十、海生乳杆菌属(Marinilactibacillus Ishikawa et a1．2003)
十一、毛发球菌属(Trichococcus Scheff et a1．1984，emend．Liu et a1．2002)
十二、明串珠菌属(Leuconostoc van Tieghem 1878)
十三、酒球菌属(Oenococcus Dicks et a1．1995)
十四、魏斯氏菌属(Weissella Collins et a1．1994)
第五节 肠球菌属和有关属及其特性
一、肠球菌属(Enterococcus Schleifer et a1．1984)
二、蜜蜂球菌属(Melissococcus Bailey and Collins 1983)
三、四联球菌属(Tetraeenococcus Collin et a1．1993)
四、漫游球菌属(Vagococcus Collins et a1．1990)
五、链球菌属(Streptococcus Rosenbach 1884)
六、乳球菌属(Lactococcus Schleifer et a1．1986)
七、乳卵形菌属(Lactovum Matthies et a1．2005)
第六节 双歧杆菌属和有关属及其特性
一、双歧杆菌属(Bidfidobacterium 0rla-Jensen 1924)
二、斯氏菌属(Scardovia Crociani et a1．1996，Jian and dong 2002)
三、类斯氏菌属(Parascardovia Crociani et a1．1996，Jian and Dong 2002)
四、气斯氏菌属(Aeriscardovia Simpson et a1．2004)
五、异斯氏菌属(Alloscardovia Geert Huys et a1．2007)
六、另类斯氏菌属(Metascardovia Okamoto et a1．2007)
七、奇异菌属(Atopobium Collins and Wallbanks 1993)
八、欧鲁森氏菌属(Olsenella Dewhirst et a1．2001)
第七节 芽孢杆菌和梭菌有关的属
一、芽孢杆菌属(Bacillus)内属于乳酸细菌的种
二、嗜盐乳杆菌属(Halolactibacillus Lshikawa et a1．2005)
三、糖球菌属(Saccharococcus Nystrand 1984)
四、利斯特氏菌属(Listeria Pirie 1940)
五、环丝菌属(Brochothrix Sneath and Jones 1976)
六、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus kitahara and Suzuki 1963)
七、孪生球菌属(Gemella Berger 1960)
八、毛形杆菌属(Lachnobacterium Whitford et a1．2001)
第八节 近年报道的乳酸细菌新属
一、矛形细菌属(Pilibacter Higashiguchi et a1．2006)
二、嗜果糖乳酸细菌属(Fructobacillus Akihito Endo et a1．2008)
三、夏普氏菌属(Sharpea Morita et a1．2008)
四、产乳酸细菌属(Lacticigenium Takao lino et a1．2009)
第二章 乳酸细菌的分离和培养
第三章 乳酸细菌的分类鉴定方法

第二篇 乳酸细菌发挥生理功能的物质基础
第四章 乳酸细菌细胞壁成分的分离和纯化
第五章 乳酸细菌产生的糖类物质
第六章 乳酸细菌产生的抗菌物质
第七章 乳酸细菌产生的其他生理活性物质

第三篇 乳酸细菌在食品、保健品和动物饲料中的应用
第八章 乳酸细菌产生的风味物质
第九章 乳酸细菌发酵食品
第十章 乳酸细菌微生态制剂的制备
第十一章 动物用益生菌剂和青贮饲料发酵剂

第四篇 乳酸细菌在疾病防治和保健中的应用
第十二章 乳酸细菌解毒和分解致癌物质
第十三章 乳酸细菌耐酸、耐胆汁和抗胁迫反应
第十四章 乳酸细菌的免疫功能与延缓衰老

第五篇 乳酸细菌在工业上的应用
第十五章 D-乳酸和L乳酸的分析
第十六章 乳酸细菌发酵生产乳酸工艺
第十七章 发酵产品中乳酸细菌的快速检测技术
第十八章 产甘露醇和多糖水解酶菌的筛选
第十九章 乳酸细菌噬菌体的检测、分离纯化和防治

第六篇 乳酸细菌安全性评估方法
第二十章 乳酸细菌对抗菌药物的敏感性
第二十一章 乳酸细菌有害酶及代谢产物的检测
第二十二章 基于基因组学的乳酸细菌安全性评价

第七篇 乳酸细菌的遗传与变异
第二十三章 乳酸细菌DNA的提取和纯化
第二十四章 乳酸细菌中基因导入和敲除的方法
第二十五章 细菌素生物合成中功能基因的克隆及作用机制分析
第二十六章 乳酸细菌菌种的保藏和防止退化变异

附录 常用培养基组分

    第一篇乳酸细菌的分类鉴定乳酸细菌（lacticacidbacteria,LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极广，物种丰富多样。乳酸细菌不仅在理论上具有学术研究价值，而且在与人类生活密切相关的领域应用广泛，但其中也包含少数的人畜有害菌。随着科技的迅速发展，细菌分类系统学与生命科学领域其他学科已紧密结合，跨学科成果的应用提升了细菌分类研究的技术方法。近十年来细菌分类的研究在采用传统实验技术的基础上，普遍使用了16SrRNA序列分析法，此外尚添加了化学分类指征和分子生物学其他的一些新技术方法，进一步明确了乳酸细菌在系统发育中的位置，重新分类和组合了原来的属种，并发现了更多的新属和新种。按《伯杰氏系统细菌学手册》近期新版本和最近几年报道的资料，目前乳酸细菌已列入细菌域的厚壁门（包括乳杆菌、芽孢杆菌和梭菌及其相关菌）和放线菌门（包括双歧杆菌及其相关菌），共计41个属，超过430种。乳杆菌属内目前报道就有150多种。双歧杆菌分类研究中由于使用了HSP60核心蛋白序列分析法，拓宽了对这类菌的认识，从而近十年来陆续增加了斯氏菌属、类斯氏菌属、气斯氏菌属、异斯氏菌属和另类斯氏菌属等。本篇以现代的视野来界定乳酸细菌的范围及其有关的属和种。描述了乳酸细菌现有41个属的主要特征，并介绍了其中具有代表性的属种的分离培养方法，以及乳酸细菌的分类鉴定实验技术，包括生化特性和化学分类特征的测定法及基因型和系统发育分类鉴定方法。第一篇乳酸细菌的分类鉴定第一章乳酸细菌的分类及有关属的特性第一章乳酸细菌的分类及有关属的特性第一节乳酸细菌的定义及其范围一、乳酸细菌的定义乳酸细菌（LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。此外，这类菌中有些细菌又是人畜的致病菌，因此受到人们极大的关注和重视。二、乳酸细菌范围的界定由于乳酸细菌应用广泛，并具有极高的价值，而且它们之中又存在人畜的致病菌，损害人体健康。还有少数种对人体是高度致病的甚至危及人的生命。为了尽可能有效地应用其有利的一面，避免其有害的一面，很有必要较全面地认识这类细菌。因此人们首先需要界定乳酸细菌的范围，了解它们目前的分类状况，包括现有哪些细菌的属和种。在乳酸细菌范围界限的划分和包括哪些细菌属种的认识方面历来存有差异。这种认识的不一致缘由也来自“乳酸细菌”这一名词的不定性。乳酸细菌有人还认为是使乳变酸的菌（milk?souringorganism）的同义语。即使通常人们理解的是LAB，而解释为能发酵糖产乳酸的细菌也需要限定条件。加之“乳酸细菌”的名称就细菌分类学而言实属一非正统非规范的名称，按其定义它们包括有不同类别的细菌，这类群菌并非全归入同一分类单位内，在系统发育中亲缘关系远近有别，而亲缘关系与它们相近的某些属种并非均属于这类菌。从早期历史来看，1919年Orla?Jensen专门论述过这类菌，也试图限定其范围，但认识上的分歧和异议仍然存在。传统的观念认为典型的乳酸细菌包括4个属：乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconotoc）、片球菌属（Pediococcus）和链球菌属（Streptococcus）。最早LAB的定义、界定范围及鉴定采用的特性为：革兰氏阳性，无芽孢，接触酶为阴性，缺细胞色素，不好氧、但耐氧，耐酸，营养要求复杂，专性发酵糖，乳酸为其主要终产物等。这些LAB的鉴别标准可能也是依据以上4个属的细菌性状界定的。由于历来存在上述“典型乳酸细菌”的概念，致使目前尚有不少人对乳酸细菌的界定范围仍沿用这些特性，缺乏对乳酸细菌的全面认识。随着细菌分类学的不断发展，以后又发现一些新的LAB属种，它们并不接近符合以上限定的特性，且发现有产生芽孢的乳酸细菌，如芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）。有的学者就明确表示不应该将这个属包括在LAB中。作者认为这一属的细菌除细胞生芽孢的性状外，其他特征包括发酵代谢糖的途径与乳杆菌属都相近，将这个属排除在LAB之外是不妥的。当然这里是针对芽孢乳杆菌属内所有的种而言，而不包括生芽孢杆菌的其他属，如需氧芽孢杆菌属（Bacillus）只有极少数种可划归为乳酸细菌（详见后述）。对于丹毒丝菌属（Erysipelothrix）是否列入乳酸细菌的属种也存有异议。鉴于该属的细菌发酵性较弱，而且从系统发育上来看它距离目前已确认的乳酸细菌的属种亲缘关系也较远，作者认为也可以将丹毒丝菌属排除在乳酸细菌之外。此外，双歧杆菌的种不符合通常对LAB的描述，从系统发育上来看它们与革兰氏阳性的放线菌关系密切，而且其糖发酵又是另一类代谢途径，有别于通常认为的LAB类群。但是在《伯杰氏细菌鉴定手册》第七版（1957年）中双歧杆菌是乳杆菌属的一个种，称之为双歧乳杆菌（L?bifidum），从历史来看双歧杆菌被认为是LAB类群的细菌，而且也可能由于它们和某些别的乳酸细菌是人和动物肠道中的重要菌系，也是重要的益生菌有关。对于双歧杆菌属归入LAB类群至今人们仍认同。关于乳酸细菌类群当前究竟包括哪些属，如何界定的问题，估计观点仍不会接近相同。只是迄今发现的乳酸细菌现仍集中在革兰氏阳性菌内，除此之外，其他认定LAB的标准几乎都受到质疑，尤其是近年来细菌分类研究进展迅速，随着新属新种不断地被发现，乳酸细菌涉及的属和种在数量上必然会增加。在划定乳酸细菌的界限问题上分歧可能也会加大。当今细菌分类研究为确定新分离菌株的分类地位，必须应用一些新的技术方法和现代分子生物学的研究手段，以其基因型的特征说明它们在系统发育上与现有菌的亲缘关系。对于它们的表型特征的了解虽然也需要，但是它们能否利用可发酵的糖（通常特指葡萄糖）产生乳酸的性状测定，对于某一新菌株的分类定位未必是必需的。这样有可能原本可归入乳酸细菌的新属种因此被遗漏掉，也使得乳酸细菌的范围界限的划分难以确定。作者在汇集近年来国内外报道的有关细菌分类文献资料的基础上，依据当今系统细菌学发展的现状，以现代的视野和观点界定乳酸细菌的范围及其有关的属种，并提供了最近发表的一些有关资料信息，以供读者参考。三、乳酸细菌有关的属在本章内确认列入乳酸细菌类群的属种可归为以下四类。第一类是以往已认定的乳酸细菌，包括：乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、气球菌属(Aerococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、利斯特氏菌属(Listeria)、环丝菌属(Brochothrix)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)内属于乳酸细菌的种。第二类是由来自第一类菌经重新分类或由它们中的某些属种重新组合又另建立的新属，包括：肉食杆菌属(Carnobacterium)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、孪生球菌属(Gemella)、营养缺陷菌属(Abiotrophia)、奇异菌属(Atopobium)、欧鲁森氏菌属（Olsenella）、嗜果糖乳酸细菌属（Fructobacillus）、斯氏菌属(Scardovia)和类斯氏菌属(Parascardovia)。第三类是已报道的一些新属，它们与以往认定的乳酸细菌属在系统发育的亲缘关系密切，表型特征糖代谢类型也相似，这类菌属包括：碱杆菌属(Alkalibacterium)、德瑟兹氏菌属(Desemzia)、棍状菌属(Isobaculum)、蜜蜂球菌属(Melisococcus)、糖球菌属(Saccharococcus)、乳卵形菌属(Lactovum)、气斯氏菌属(Aeriscardnvia)、异斯氏菌属(Alloscardovia)和另类斯氏菌属(Metascardovia)。第四类是已报道的新属，报道者在描述其特性和建立新属时明确说明它们是属于乳酸细菌类群的，包括：类乳杆菌属(Paralactobacillus)、海生乳杆菌属(Marinilactibacillus)、嗜盐乳杆菌属(Halolactibacillus)、毛形杆菌属（Lachnobacterium）、矛形细菌属(Pilibacter)、夏普氏菌属(Sharpea)和产乳酸细菌属(Lacticigenium)。