基于"TLRS信号通路"的"调衡防控"分子机制研究

通过对预针刺不同配穴（合募配穴和俞募配穴）及腹部推拿，研究其对应激性胃溃疡(SGU)大鼠胃黏膜形态的影响和对血清及胃组织中氧化-抗氧化与炎症相关因子的影响，以及对胃组织TLRs信号通路及大肠组织TLRs信号通路相关mRNA的影响，从多角度分析不同配穴预针刺及腹部推拿对应激性胃溃疡大鼠黏膜组织的保护作用。探讨预针刺不同配穴及腹部推拿对保护黏膜组织作用上的效应差异，以期对腧穴配伍理论及腹部推拿治疗提供实验依据。

通化师范学院医药学院讲师，医学博士。中国针灸学会临床分会理事，世界中医药学会联合会痧疗罐疗专业委员会理事，吉林省针灸学会理事。多年来一直从事氧化-抗氧化相关疾病的研究工作，作为项目负责人主持承担吉林省科技厅，吉林省教育厅、吉林省中医药管理局项目各1项。参与国家自然科学基金项目2项。迄今已发表文章20多篇，其中SCI收录论文5篇，中文核心收录论文3篇。作为主要编者编著《图说中医文化》《灸法医鉴》《百病一针灵》等书籍。

第1部分 预针刺不同配穴对SGU大鼠模型胃组织的影响
1预针刺不同配穴对SGU大鼠胃黏膜的形态学影响2
1.1实验材料2
1.1.1实验动物及分组2
1.1.2主要仪器及试剂2
1.2实验方法3
1.2.1实验动物分组及干预方法3
1.2.2造模方法4
1.2.3观察指标及检测方法5
1.2.4统计分析6
1.3实验结果7
1.3.1各组大鼠胃组织大体形态比较7
1.3.2各组大鼠胃溃疡组织形态学比较7
1.4小结8
1.5讨论9
1.5.1胃溃疡的现代及中医的认识9
1.5.2水浸束缚应激性胃溃疡动物模型的发展变化24
1.5.3论合募配穴和俞募配穴25
1.5.4合募配穴和俞募配穴防治应激性胃溃疡的效应规律分析26
2预针刺不同配穴对SGU大鼠血清及胃组织氧化因子及炎性因子的影响28
2.1实验材料28
2.1.1实验动物及分组28
2.1.2主要仪器与试剂28
2.2实验方法29
2.2.1TBA法测定血清SOD水平29
2.2.2TBA法测定血清MDA水平29
2.2.3比色法测定血清及胃组织MPO水平29
2.2.4硝酸还原酶法测定血清及胃组织NO水平29
2.2.5比色法测定胃组织GSH-Px水平30
2.2.6ELISA法检测血清IL-1β #65380;TNF-α和IL-6 #65380;ET-1水平30
2.2.7统计分析30
2.3实验结果30
2.3.1各组大鼠胃组织中氧化-抗氧化因子的水平30
2.3.2各组大鼠血清中氧化-抗氧化因子的水平31
2.3.3各组大鼠血清中炎症细胞因子的含量31
2.4小结32
2.5讨论33
2.5.1氧化-抗氧化因子系统对黏膜组织的影响33
2.5.2炎症细胞因子对黏膜组织的影响35
2.5.3针刺对氧化应激的影响研究概况及发展趋势35
3预针刺不同配穴对SGU大鼠胃组织TLRs信号通路的影响38
3.1实验材料38
3.1.1实验动物及分组38
3.1.2主要仪器与试剂38
3.2实验方法40
3.2.1干预方法40
3.2.2造模方法40
3.2.3免疫组化染色法观察胃组织TLR4 #65380;MyD88 #65380;TRIF蛋白表达情况40
3.2.4Westen lot法检测胃组织中TLR4 #65380;MyD88 #65380;IκB-α蛋白的表达41
3.2.5统计分析41
3.3实验结果42
3.3.1各组大鼠胃组织的TLR4 #65380;MyD88 #65380;TRIF免疫组化结果42
3.3.2各组大鼠胃组织的TLR4 #65380;MyD88 #65380;IκB-α蛋白免疫印迹结果43
3.4小结44
3.5讨论45
3.5.1TLRs信号通路对黏膜组织的影响45
3.5.2针刺对TLRs信号通路的影响46
3.5.3炎症 #65380;氧化应激与TLRs信号通路的关系49
3.5.4TLRs信号通路对“氧化-抗氧化”平衡的影响49
3.5.5不同配穴针刺治疗胃溃疡机制的研究进展54
3.5.6预针刺对保护黏膜组织的“调衡防控”分子机制59
3.5.7不同配穴组方与功效的探讨60

第2部分 预针刺不同配穴对SGU大鼠大肠组织TLRs信号通路mRNA的影响
4预针刺不同配穴对SGU大鼠大肠组织TLRs信号通路mRNA的影响64
4.1实验材料64
4.1.1实验动物及分组64
4.1.2主要仪器及试剂64
4.2实验方法65
4.2.1干预方法65
4.2.2造模方法65
4.2.3样本采集与大肠组织RNA提取65
4.2.4总RNA质量检测66
4.2.5分析纯化mRNA及片段化66
4.2.6合成第一链cDNA66
4.2.7合成第二链cDNA66
4.2.8双链cDNA末端修复反应66
4.2.93′末端加“A”反应67
4.2.10连接测序接头67
4.2.11文库片段筛选67
4.2.12PCR扩增DNA文库67
4.2.13文库的质量检测67
4.2.14上机测序68
4.3实验过程68
4.3.1采用FastQC测序数据,对原始数据质量评估68
4.3.2采用Timgaloe测序数据质量控制68
4.3.3采用HISAT2参考基因组比对68
4.3.4采用Rseqc对转录组整体质量评估68
4.3.5采用StingTie进行基因表达定量69
4.3.6采用deseq2进行差异基因鉴定69
4.4实验结果70
4.4.1mRNA质量质控结果70
4.4.2mRNA数据质控结果71
4.4.3各组mRNA差异表达比较72
4.4.4各组样品TLRs信号通路差异基因的GO富集比较73
4.4.5各组样品TLRs信号通路差异基因的KEGG富集分析74
4.5小结75
4.6讨论76
4.6.1胃和大肠在消化系统胚胎发育上是同源的76
4.6.2胃和大肠在中医脏腑关系中联系紧密76
4.6.3合募配穴组与俞募配穴组对应激性胃溃疡大鼠黏膜的保护的共同基因77
4.6.4合募配穴组对应激性胃溃疡大鼠黏膜的保护作用的基因77
4.6.5俞募配穴组对应激性胃溃疡大鼠黏膜的保护作用的基因77

第3部分 预针刺与奥美拉唑对SGU模型大鼠胃组织保护作用研究
5预针刺合募配穴预防应激性胃溃疡模型大鼠胃组织保护作用的机制研究82
5.1实验材料82
5.1.1实验动物及分组82
5.1.2主要仪器及试剂82
5.2实验方法83
5.2.1大鼠SGU模型的建立83
5.2.2干预方法83
5.2.3检测指标及方法84
5.2.4统计分析85
5.3实验结果85
5.3.1各组大鼠胃组织肉眼形态比较85
5.3.2各组大鼠胃黏膜组织形态学比较85
5.3.3各组大鼠血清中MDA #65380;MPO #65380;GSH-Px水平比较87
5.3.4各组大鼠胃组织中MDA #65380;MPO #65380;GSH-Px水平比较88
5.3.5各组大鼠血清中炎性因子含量比较89
5.3.6各组大鼠胃组织中TLR4 #65380;MyD88 #65380;IκB-α蛋白表达比较89
5.4小结90
5.5讨论90
6预针刺俞募配穴对应激性胃溃疡模型大鼠胃组织保护作用的机制研究92
6.1实验材料92
6.1.1实验动物92
6.1.2动物分组及处理92
6.2实验方法93
6.2.1束缚-水浸法应激性胃溃疡模型制备93
6.2.2样本采集与胃溃疡指数测定93
6.2.3血清细胞因子测定94
6.2.4组织细胞因子测定94
6.2.5ELISA实验评估94
6.2.6组织学观察94
6.2.7免疫印迹实验95
6.2.8统计分析95
6.3实验结果95
6.3.1俞募配穴对大鼠模型胃黏膜肉眼观及溃疡指数变化95
6.3.2俞募配穴降低胃的UI指数情况96
6.3.3俞募配穴对模型大鼠组织形态学的影响96
6.3.4俞募配穴降低血清和胃组织中过氧化物的水平97
6.3.5俞募配穴可降低血清炎症因子的表达99
6.3.6俞募配穴对TLR4 #65380;MyD88和NF-κBp65蛋白表达的抑制作用99
6.4小结100
6.5讨论100
6.5.1研究结果100
6.5.2预针刺俞募配穴对胃黏膜的“调衡防控”机制102

第4部分 腹部推拿对应激性胃溃疡的保护作用研究
7腹部推拿对应激性胃溃疡的保护作用研究106
7.1实验材料106
7.1.1实验动物及分组106
7.1.2主要仪器及试剂106
7.2实验方法106
7.2.1实验动物分组及干预方法106
7.2.2造模方法107
7.2.3统计分析107
7.3实验结果107
7.3.1腹部推拿对预防SGU各组大鼠胃组织损伤有作用107
7.3.2腹部推拿预防SGU胃组织损伤可能通过调节“氧化-抗氧化”平衡108
7.4讨论111
7.4.1“经络联系至心脑”是腹部推拿起到“调神”作用的前提111
7.4.2“调理脏腑”是腹部推拿起到“调神”的基础112
7.4.3腹部推拿可通过“畅通气机”而达到“调神”的目的112
参考文献
附录