牡丹复色花瓣显色机理研究

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第1章绪论/001 1.1植物花色与花青苷/003 1.1.1植物花色的形成机理/003 1.1.2花青苷的结构与种类/004 1.1.3花青苷的理化性质/005 1.1.4花青苷的生理和生物功能/005 1.2花青苷的生物合成及基因调控/006 1.2.1花青苷的生物合成途径/006 1.2.2花青苷合成的关键结构基因/007 1.2.3调控花青苷合成的相关转录因子/012 1.2.4与花青苷合成调控相关的miRNA/014 1.3RNA-seq技术/017 1.4植物复色花显色机理的研究进展/018 1.5牡丹花色形成及差异机理的研究进展/022 第2章牡丹复色花瓣显色生理机理研究/027 2.1牡丹复色花瓣的花色指数/028 2.1.1花色指数的测试方法/028 2.1.2花色指数的测定分析/028 2.2牡丹复色花瓣中的可溶性糖含量/028 2.2.1可溶性糖含量的测试方法/028 2.2.2可溶性糖含量的测定分析/029 2.3牡丹复色花瓣中的液泡pH值/030 2.3.1液泡pH值的测试方法/030 2.3.2液泡pH值的测定分析/030 2.4牡丹复色花瓣中的金属元素含量/031 2.4.1金属元素含量的测试方法/031 2.4.2金属元素含量的测定分析/031 2.5牡丹复色花瓣中的花青苷组成和含量/033 2.5.1花青苷组成和含量的测试方法/033 2.5.2花青苷组成和含量的测定分析/033 2.6牡丹复色花瓣中的黄酮、黄酮醇组成和含量/035 2.6.1黄酮、黄酮醇组成和含量的测试方法/035 2.6.2黄酮、黄酮醇组成和含量的测定分析/036 2.7牡丹复色花瓣的上表皮细胞形状/037 2.7.1上表皮细胞形状的测试方法/037 2.7.2上表皮细胞形状的观察分析/038 2.8牡丹复色花瓣的花色与主要生理指标的相关性分析/038 第3章牡丹复色花瓣显色分子机理研究/041 3.1牡丹复色花瓣的转录组测序（mRNA-seq）/042 3.1.1转录组测序所用总RNA的提取/042 3.1.2转录组测序与De novo组装/044 3.1.3unigene的功能注释与分类/046 3.1.4差异表达基因的分析/051 3.1.5牡丹花瓣复色形成相关基因的荧光定量PCR（qRT-PCR）验证/054 3.2牡丹复色花瓣显色相关关键结构基因PsDFR的克隆及序列分析/057 3.2.1牡丹复色花瓣中PsDFR基因cDNA全长的克隆/058 3.2.2牡丹复色花瓣中PsDFR基因组DNA全长的克隆/062 3.2.3牡丹复色花瓣中PsDFR启动子区域的克隆/065 3.2.4牡丹复色花瓣中PsDFR启动子区域甲基化水平的测定/070 3.3牡丹复色花瓣的小RNA测序（sRNA-seq）/072 3.3.1小RNA测序所用总RNA的提取/072 3.3.2小RNA文库构建和测序/074 3.3.3牡丹复色花瓣中miRNA的鉴定及靶基因的预测/076 3.3.4miRNA的差异表达分析/078 3.3.5差异表达miRNA靶基因的功能富集/078 3.3.6牡丹花瓣复色形成相关的差异表达miRNA/081 3.3.7牡丹复色花瓣小RNA测序结果的荧光定量PCR（qRT-PCR）验证/081 3.4牡丹花瓣复色形成相关的关键转录因子的筛选/083 3.4.1MYB家族相关转录因子的筛选/083 3.4.2bHLH家族相关转录因子的筛选/085 3.4.3WD40和SPL家族相关转录因子的筛选/085 3.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的克隆及功能验证/087 3.5.1牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因全长的克隆/087 3.5.2牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的生物信息学分析/088 3.5.3牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的时空表达模式分析/094 3.5.4牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的亚细胞定位/095 3.5.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在拟南芥中的功能验证/099 3.5.6牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在苹果愈伤组织中的功能验证/107 3.6牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR基因启动子结合和转录活性的验证/112 3.6.1牡丹PsMYB114L、PsMYB12L与PsDFR启动子结合的酵母单杂交验证/112 3.6.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR启动子激活的双荧光素酶报告验证/115 第4章牡丹复色花瓣显色机理初步解析/119 4.1牡丹复色花瓣显色相关的关键生理原因/120 4.2牡丹花瓣复色形成相关的关键基因的初步确定/121 4.2.1基于转录组测序筛选与牡丹花瓣复色形成相关的差异表达基因/121 4.2.2牡丹花瓣复色形成相关的关键结构基因的初步确定/122 4.2.3牡丹复色花瓣中关键结构基因PsDFR的克隆和序列比对/123 4.2.4基于小RNA测序筛选与牡丹花瓣复色形成相关的差异表达miRNA/124 4.2.5牡丹花瓣复色形成相关的关键转录因子的初步确定/126 4.3牡丹花瓣复色形成相关的关键基因的功能研究/127 4.3.1牡丹关键转录因子PsMYB114L和PsMYB12L的克隆及过表达/127 4.3.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR基因调控的验证/130 附录本研究相关基因的引物序列/131 参考文献/138